Imágenes de paquetes de estereocilios con resolución a nanoescala en células ciliadas auditivas de mamíferos vivos

Las células ciliadas del oído interno detectan los desplazamientos inducidos por el sonido y transducen estos estímulos en señales eléctricas en un haz de cabello que consiste en estereocilios que están dispuestos en filas de altura creciente. Cuando los estereocilios se desvían, tiran de pequeños enlaces de punta extracelular (~ 5 nm de diámetro) que interconectan estereocilios, que transmiten fuerzas a los canales de transducción mecanosensibles. Aunque la mecanotransducción se ha estudiado en células ciliadas vivas durante décadas, los detalles ultraestructurales funcionalmente importantes de la maquinaria de mecanotransducción en las puntas de los estereocilios (como la dinámica del enlace de la punta o la remodelación de los estereocilios dependientes de la transducción) aún se pueden estudiar solo en células muertas con microscopía electrónica. Teóricamente, las técnicas de sonda de barrido, como la microscopía de fuerza atómica, tienen suficiente resolución para visualizar la superficie de los estereocilios. Sin embargo, independientemente del modo de imagen, incluso el más mínimo contacto de la sonda de microscopía de fuerza atómica con el haz de estereocilios generalmente daña el haz. Aquí presentamos un protocolo detallado para la microscopía de conductancia iónica de sonda de salto (HPICM) de imágenes de células ciliadas auditivas de roedores vivos. Esta técnica de sonda de escaneo sin contacto permite obtener imágenes de lapso de tiempo de la superficie de células vivas con una topografía compleja, como las células ciliadas, con una resolución de nanómetros únicos y sin hacer contacto físico con la muestra. El HPICM utiliza una corriente eléctrica que pasa a través de la nanopipeta de vidrio para detectar la superficie de la célula en las proximidades de la pipeta, mientras que un sistema piezoeléctrico de posicionamiento 3D escanea la superficie y genera su imagen. Con HPICM, pudimos obtener imágenes de paquetes de estereocilios y los enlaces que interconectan estereocilios en células ciliadas auditivas vivas durante varias horas sin daños notables. Anticipamos que el uso de HPICM permitirá la exploración directa de los cambios ultraestructurales en los estereocilios de las células ciliadas vivas para una mejor comprensión de su función.