Abstract
Biochemistry
Die Fettacylierung, die kovalente Zugabe gesättigter Fettsäuren zu Proteinsubstraten, ist wichtig für die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Funktionen zusätzlich zu ihren Auswirkungen auf Krebs und neurodegenerative Erkrankungen. Jüngste Entwicklungen bei Fettacylierungsnachweismethoden haben einen effizienten und ungefährlichen Nachweis von fettacylierten Proteinen ermöglicht, insbesondere durch den Einsatz von Klickchemie mit bioorthogonaler Markierung. Der Nachweis der Klickchemie kann jedoch durch die schlechte Löslichkeit und die potenziellen toxischen Wirkungen der Zugabe von langkettigen Fettsäuren zur Zellkultur eingeschränkt werden. Beschrieben wird hier ein Markierungsansatz mit optimierter Abgabe unter Verwendung von verseiften Fettsäuren in Kombination mit fettsäurefreier BSA sowie entlipidierten Medien, die den Nachweis von schwer nachweisbaren fettacylierten Proteinen verbessern können. Dieser Effekt war am ausgeprägtesten beim Alkynylstearat-Analogon 17-ODYA, das das am häufigsten verwendete Fettsäureanalogon beim Nachweis von akylierten Proteinen in der Klickchemie war. Diese Modifikation verbessert die zelluläre Inkorporation und erhöht die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis von acylierten Proteinen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz in einer Vielzahl von Zelltypen angewendet und mit anderen Assays wie der Pulse-Chase-Analyse, der stabilen Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur und der Massenspektrometrie zur quantitativen Profilierung von fettacylierten Proteinen kombiniert werden.
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