עבודה זו מומנה על ידי המועצה הלאומית למדע והנדסה (NSERC; RGPIN-2019-04617). לוסיה ליאו מומנה על ידי מלגת הזיכרון של ראם ולקהה טומקור באמצעות המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ווטרלו, ובורסרי הזיכרון של לוסי מוריסון באמצעות IODE אונטריו, בנוסף למימון המחקר לתואר שני מאוניברסיטת ווטרלו הכולל את הסטודנטים לחקר התואר השני (50503-11072), פרס בוגר מדעים ועוזרת הוראה לתארים מתקדמים. המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת מרטין על תמיכתם בהכנת כתב יד זה, במיוחד סטפני רייאל, הארלין גיל וסאדיה חאן שעזרו בתחילה להקים את מעבדת מרטין כהכנה למחקרים אלה. המחברים רוצים גם להודות לד"ר לוק ברתיום על המתנה האדיבה של מבני ctHTT-GFP וד"ר שון סנדרס על קלט ביקורתי בהכנת כתב היד. איור 3 נוצר עם BioRender.com.

1. תרבות התא
<ol><li>להשלמת DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco) לתרבות תאים, הוסיפו 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1x פניצילין-סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-100 מ"מ נתרן פירובט (1% נפח/נפח).</li>
	<li>צלחת כ 5 x 105 HEK293T תאים / באר של צלחת תרבית רקמות 6 באר לגדול במשך 18 שעות בחממה לחה 37 °C עם 5% CO2 כדי להגיע 75%-80% מפגש.</li>
	<li>חסך בסרום חומצות שומן<ol>
<li>כדי להכין מדיית תיוג, הכן את DMEM כאמור (שלב 1.1) ללא 10% FBS. החלף את FBS ב- FBS מצופה פחם של 5% Dextran (DCC-FBS). יש לחמם מראש ל-37°C (50°F) לפני השימוש.</li>
		<li>שטפו בעדינות את התאים עם תמיסת מלח אחת עם חוצץ פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר והחליפו במדיה עם תיוג. הערה: תאי HEK293T מתנתקים מלוחות תרבית רקמות בקלות. יש להקפיד בעת שטיפת תאים והחלפת מדיה. למזער את התסיסה במהלך ההעברה אל האינקובטור וממנו ככל האפשר.</li>
		<li>החזירו את התאים לחממה של 37 °C עם 5% CO2 ודגרו כ -45 דקות (מינימום 15 דקות יעיל), עד 60 דקות, לפני שתמשיכו עם תיוג מטבולי עם חומצות שומן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה וספוניפיקציה של אנלוגים חומצות שומן
<ol><li>הכן את פתרונות המלאי של חומצות שומן אלקיניל מראש על ידי solubilizing ב- DMSO כדי להשיג את הריכוזים הבאים ולאחסן ב -20 °C (60 °F). להפשיר בטמפרטורת החדר לפי הצורך. אחסן את ההכנות לביצועים הטובים ביותר שלהם תחת N2 או Ar. אלקיניל-מיריסטט (13-טטרדצינואית חומצה, 13-TDYA): 25 מ"ר אלקיניל-פלמיטט (15-חומצה הקסדצינואית; 15-HDYA): 100 מ"ר אלקיניל-סטארט (17-חומצה אוקטדיצינואית; 17-ODYA): 100 מ"ר
</li>
	<li>כדי להכין 20% חומצות שומן ללא BSA (FAFBSA), לשקול 2 גרם של FAFBSA בצינור חד פעמי 50 מ"ל.<ol>
<li>יש להביא עד 10 מ"ל עם DMEM שחומם מראש (37°C).</li>
		<li>יש לערבב על-ידי סיבוב מקצה לקצה או על-ידי מערבולת, ומניחים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את FAFBSA.</li>
		<li>השתמש במסנן 0.2 מיקרומטר כדי לסנן את המדיום.</li>
		<li>Aliquot בכרכים של כ 1 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (60 °F). להפשיר לפי הצורך ולחמם עד 37 °C (50 °F) באמבט מים לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לשפר את המסיסות של חומצת השומן ואנלוגי חומצות שומן, saponify על ידי דגירה עם 20% טוחן עודף של אשלגן הידרוקסיד (KOH) בבקבוקוני תגובה חרוטית זכוכית 3 מ"ל. הערה: בקבוקונים אלה מאפשרים למלח להישאר מסיס תוך הבטחת FAFBSA אינו congeal מן החום הגבוה. השימוש בזכוכית גם מונע מחומצות שומן להידבק לפלסטיק.<ol>
<li>פיפטה החוצה לפחות 2 μL של חומצת שומן אלקיניל אנלוגי ישירות לתחתית בקבוקון תגובה חרוטי 3 מ"ל. הכן 2 μL של שומנים בדם לכל באר של צלחת 6-well בשימוש (ראה טבלה 1). הערה: בשל הידרופוביות של חומצות שומן, עדיף לצפות את קצה פיפטה על ידי ציור את הנפח הרצוי מספר פעמים לפני חלוקתו לתוך בקבוקון התגובה.</li>
		<li>לדלל 1 M KOH לריכוזים שווים 20% טוחנת עודף של תווית חומצת השומן אלקיניל (30 מ"מ עבור 13-TDYA ו 120 מ"מ עבור 15-HDYA ו 17-ODYA).</li>
		<li>פיפטה החוצה כמות שווה של KOH מדולל (1 μL : 1 μL חומצת שומן : KOH) קרוב לתחתית בקבוקון התגובה על קצה הזכוכית, כך נפח מחלק של KOH מתערבב עם חומצת השומן.</li>
		<li>סגור את המכסה של הבקבוקון והקש בעדינות כדי לערבב את הפתרונות. הערה: התערובת עשויה להתמצק במהירות, במיוחד לאורכים הולכים וגדלים של שרשרת הפחמימנים של חומצת השומן. היזהר לא לשפשף את מוצק (כלומר, לא לערבב על ידי צנרת).</li>
		<li>מחממים את בקבוקון התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך כ-5 דקות, או ברגע שחומצת השומן משולבת (הפתרון מתבהר). הערה: חומצות שומן עם מספר גבוה יותר של פחמנים וירידה במסיסות, כגון סטארט (17-ODYA), עשויות לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר כדי להשתלב באופן מלא ב- KOH ב 65 °C (65 °F). העלו את הטמפרטורה ל-70 מעלות צלזיוס במידת הצורך. אמבט מים הוא הטוב ביותר. יש לדאוג כי הנוזל אינו מתאדה יותר מדי.</li>
		<li>לאחר שחומצות השומן נכנסו לתמיסה ולא נותרו מוצקים נראים לעין, פיפטה הקדימה 20% FAFBSA כך שיחס הנפח של חומצות שומן: KOH: FAFBSA הוא 1: 1: 50 כדי להשיג ריכוז סופי של חומצות שומן אלקיניל קשורות BSA 20x.</li>
		<li>מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה. הפתרון נראה בדרך כלל ברור ללא מוצקים גלויים. הערה: בדרך כלל, כל מוצקים קטנים ייכנסו לפתרון לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לדגור חומצת השומן ו FAFBSA במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F). הערה: התווית saponified בשלב זה יציבה מעבר ל -15 דקות. 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>סה"כ נפח מדיה (mL)</td>
			<td>Vol. חומצת שומן או חומצת שומן אנלוגית (μL)</td>
			<td>Vol. KOH (μL)</td>
			<td>Vol. 20% FAFBSA (μL)</td>
			<td>סה"כ כרך של תווית סאפוני מצומדת BSA (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: יחסי תיוג חומצות שומן סאפוניים. כמויות ניסיוניות של חומצות שומן, KOH, ו- FAFBSA עבור saponification של תווית חומצות שומן על פי נפח המדיה המשמשת.
<ol start="4"><li>כפקד, חזור על שלב 2.3. עם חומצות שומן ללא תווית אלקין.</li>
	<li>סמן את התאים עם נפח של 1/20 של חומצת שומן 20x-BSA מצומד ישירות על מדיה רעב (בדרך כלל, 100 μL ב 2 מ"ל מדיה / תאים) כדי להשיג ריכוז סופי של 1% BSA ו 25 מיקרומטר עבור אלקיניל-מיריסטט, או 100 מיקרומטר עבור אלקיניל-פלמיטט ואלקיניל-סטארט. הערה: כדי למזער את כמות ההפרעה הפיזית לתאים המצורפים, צור טיפה בקצה הפיפטה קרוב לפני השטח של המדיה במקום להזרים ישירות למדיה. אם משתמשים במעכבי התאצות, יש להוסיף לפחות 15 דקות לפני חומצות השומן המסומנות. הזמנים עשויים להשתנות בהתאם לתאים או למדכא המשמשים. הומלץ להשתמש בספוניפיקציה לשלב זה גם כן28.<ol>
<li>לשם השוואה, להוסיף שומנים שאינם saponified על ידי pipetting 2 μL (או שווה ערך נפח saponified) של חומצת שומן ללא תווית ישירות לתוך התקשורת רעב.</li>
		<li>מחזירים את התאים לאינקובטור ודוללים במשך 3-6 שעות. הערה: ייתכן שיהיה צורך לקבוע תזמון תיוג אופטימלי עבור כל סוג תא או מצב ניסיוני. זמני דגירה ארוכים יותר עלולים להוביל לפירוק חומצות השומן על ידי חמצון β ו/או שילוב בקבוצות שומנים אחרים, כגון פוספוליפידים28.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>קציר וlyse התאים עם 500 μL ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)ללא רדיואימונופרציפציה (RIPA) נטולת רדיואימונופרציפציה (RIPA) מאגר (0.1% SDS, 50 mM N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N-אתנסולפוני (HEPES) pH 7.4, 150 מ"מ נקל, 1% חומר ניקוי לא דנטורטור, 0.5% נתרן דאוקסיכולט, 2 מ"מ MgCl2 עם תוספת טרייה של 1 מ"מ פנילמאתילסולפוניל פלואוריד (PMSF), ו-10 מיקרוגרם/μL Pepstatin A (או קוקטייל מעכב פרוטאז מלא ללא EDTA)) על ידי נדנדת הליסטים למשך 15 דקות ב-4 °C .<ol>
<li>צנטריפוגה lysates ב 16,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F).</li>
		<li>לאסוף את supernatant בצינורות microcentrifuge 1.7 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (80 °F) עד מוכן להמשיך עם תגובת לחיצה. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. Lysates יציבים ב -20 °C (65 °F) עד 1 חודש. עם זאת, מומלץ להמשיך עם תגובת הקליק בזמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכמת את ריכוזי החלבון באמצעות בדיקה מתאימה לפי פרוטוקול היצרן, כגון בדיקת חומר ניקוי תואמת (DC).</li>
</ol>3. לחץ על תגובה על lysates תא
<ol><li>הכן את הריאגנטים לכימיה של קליקים.<ol>
<li>להמיס טריס-(benzyltriazolylmethyl) אמין (TBTA) ב- DMSO עד 2 מ"מ. יש לאחסן באותיות קטנות עם ייבוש בטמפרטורה של עד 20°C למשך עד 2-3 חודשים. מומלץ לאחסן תחת N2 או Ar.</li>
		<li>להמיס CuSO4 במים ddH2O כדי להשיג 50 mM. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים.</li>
		<li>ממיסים טריס-קרבוקסיתילפוספין (TCEP) במים ddH2O עד 250 מ"מ. יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) ולבצע דילול טרי של 50 מ"מ רגע לפני תגובת הלחיצה.</li>
		<li>הכן 2 mM אזיד ב- DMSO. יש לאחסן באותיות קטנות עם ייבוש בטמפרטורה של עד 20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. מומלץ לאחסן תחת N2 או Ar. הערה: זה נצפתה כי המוצרים עם שלוש קבוצות גליקול פוליאתילן או יותר עבדו הכי טוב עם ביוטין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הביאו 50-100 מיקרוגרם של ליסט חלבון בצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.7 מ"ל לאותו נפח באמצעות אותו מאגר תמוגה כמו לעיל. הערה: שמור על עוצמת התגובה קטנה ככל האפשר (20-100 μL).<ol>
<li>הוסף נתרן דודציל גופרתי (SDS) לכל מדגם כדי להשיג ריכוז סופי של 1%.</li>
		<li>הכן תערובת ראשית של ריאגנטים קליקים כך שהריכוזים הסופיים לאחר התוספת לליסטים הם: 100 מיקרומטר TBTA (מלאי 2 מ"מ), 1 mM CuSO4, (50 מ"מ מלאי) 1 mM TCEP (מלאי 50 מ"מ), ו 100 μM azide בדיקה (2 mM מלאי). שלב פתרונות מלאי בהתאם (ראה טבלה 2). הערה: ההזמנה חשובה. יש לערבב לחלוטין לאחר התוספת של כל רכיב.</li>
		<li>הוסף אמצעי אחסון מתאימים של תערובת המאסטר לליסטים. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה.</li>
		<li>דגירה במשך 30 דקות בחושך באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. להסתיז / לערבב מדי פעם.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>נפח תגובה כולל (μL)</td>
			<td>חלבון Vol. (μL)</td>
			<td>Vol. TBTA (2 מ"מM) (μL)</td>
			<td>Vol. CuSO4 (50 מ"ר) (μL)</td>
			<td>Vol. TCEP (50 מ"ר) (μL)</td>
			<td>גשושית כף אזידו (2 מ"מ) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: לחץ על יחסי ריאגנט ונפח חלבון. כרכים ניסיוניים של ריאגנטים כימיים קליק וריכוזים מלאי מקבילים, בנוסף לנפחים של דגימות חלבון.
4. לחץ על תגובה על חלבונים immunoprecipitated
<ol><li>לחלופין, ניתן לבצע את תגובת הקליק על חלבונים immunoprecipitated (IP) על או מחוץ לחרוזים. הערה: בדרך כלל, ביצוע לחיצה על החרוזים מוביל לרקע הנמוך ביותר והוא הטוב ביותר בעת בדיקת חלבונים חדשים של עניין.<ol>
<li>תאים Transfect עבור חלבון העניין, במקרה זה, wildtype myristoylated C-מסוף ציד (HTT) התמזגו GFP (myr-ctHTT-GFP) ו ctHTT-GFP עם תחליף G2A, באמצעות סידן פוספט DNA coprecipitation, כפי שתואר בעבר41.<ol>
<li>צלחת 2.5 x 105 תאים / גם בלוחות תרבית רקמות 6-well ולגדול בן לילה ~ 70-80% מפגש.</li>
			<li>הכן את תערובת ה- DNA על ידי הוספת DNA 2.5 מיקרוגרם ב 10 μL עם 99.75 μL מולקולרי כיתה H2O לצינור microcentrifuge 1.7 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 15.25 μL CaCl2 dropwise לתערובת ה- DNA.</li>
			<li>הוסף תערובת DNA / CaCl2 לצינור נפרד המכיל 125 μL 2x HEPES תמיסת מלח חוצצת (HBS, pH 7.0) באופן טיפה עם ערבוב.</li>
			<li>הוסף לאט את תערובת הדנ"א/CaCl2/HBS לתאים. לאחר 2-4 שעות, להחליף את התקשורת ולדגור בן לילה. המשך עם תיוג משלבים 1.3-2.8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכן נפחים שווים של חלבון 500 מיקרוגרם במאגר תמוגה.</li>
		<li>בצע IP על ידי דגירה עם ארנב אנטי GFP עבור ctHTT-GFP מסתובב לילה ב 4 °C (60 °F).</li>
		<li>הוסף 15-20 μL חלבון G חרוזים מראש שיווי משקל עם חיץ תמוגה לכל צינור ולאפשר לו להגיב סוף סוף ב 4 °C (60 °F) עבור 3 שעות.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים עם מאגר תמוגה resuspend ב 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES חוצץ.</li>
		<li>מחממים את החרוזים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות והופכים את הצינורות או מתסיסים בערך כל 5 דקות. לסובב בקצרה את הצינורות ולחזור 80 °C (80 °F).</li>
		<li>לאסוף את supernatant המכיל את החלבונים בעוד הדגימות עדיין חמות. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן וניתן לאחסן את הדגימות immunoprecipitated ב- -20 °C (60 °F) או -80 °C (60 °F), אם לא נעשה בה שימוש לכימיה בלחיצה באופן מיידי.</li>
		<li>אפשר 43 μL של supernatant להגיב עם 7 μL תערובת מאסטר של ריאגנטים קליק.</li>
		<li>המשך עם התגובה כאמור בשלב 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGE וסגירה מערבית
<ol><li>עצור את התגובה ואת denature על ידי הוספת 1x מאגר טעינת מדגם המכיל 25 mM dithiothreitol (DTT) וחום ב 95 °C (5 דקות). הערה: ניתן להשתמש בעד 100 מ"מ DTT28. אין להשתמש β-mercaptoethanol עם חלבונים S-acylated כפי שהוא יכול הידרוליזה קשרים thioester ולהסיר את אנלוגי חומצת שומן קליק.</li>
	<li>סובבו בקצרה את הדגימות.</li>
	<li>הפרד את החלבונים עם SDS-PAGE על ג'ל פוליאקרילאמיד, בכפילויות. הערה: שני ג'לים נדרשים לטיפול אלקליין עם KOH כדי לאשר את נוכחותם של קשרים thioester. אם משתמשים בבדיקת אזיד פלואורסצנטית, ניתן לזהות את האצילות בג'ל או לאחר ההעברה באמצעות ערוץ העירור המצוין.</li>
	<li>העברה לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) (מופעל במתנול ושטוף ב- ddH2O - 5 דקות כל אחד) עם מנגנון העברה יבש למחצה ב 25 V, 1.0 A (קבוע) במשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר שטיפה קצרה של הממברנות עם ddH2O, להשרות קרום לשכפל אחד ב 0.1 M KOH במתנול / מים (9:1 v / v) והשני ב 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 במתנול / מים (9:1 v / v) כמו בקרה לא אלקליין במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה.</li>
	<li>לשטוף את הממברנות לזמן קצר במים ddH2O, ואחריו 6 פעמים של 5 דקות שטיפות PBS-T (1x PBS, 0.1% Tween 20). הערה: יש לשטוף היטב.</li>
	<li>לחסום את הקרומים לילה ב 5% מאגר חסימת חלב רזה (1x PBS, 0.1% Tween20).</li>
</ol>6. לבצע כתם מערבי
<ol><li>כאשר מצוין, בדיקה עם Streptavidin מתויג פלואורסצנטית (1:5000) ובקרת טעינה, רודמין נגד GAPDH (1:5000) ב 5% BSA חסימת חוצץ (0.01% SDS, 1x PBS, 0.1% Tween20) בטמפרטורת החדר במשך 45-60 דקות עם נדנדה עדינה, בחושך.<ol>
<li>בדוק את כתם החלבון immunoprecipitated תחילה עם נוגדן אנטי GFP ראשוני ב 5% מאגר חסימת חלב רזה, ולאחר מכן עם נוגדנים משניים מתאימים ב 5% BSA כמו בשלב 6.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את הממברנות במשך 5 דקות PBS-T (1x PBS, 0.1% Tween20) בסך הכל ארבעה חזרות ולשטוף עם מים ddH2O לפני הדמיה.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תוספת ישירה של חומצות שומן לתאים בתרבית יכולה לגרום לחוסר מסיסות, משקעים של שומנים, ו lipotoxicity40. כתוצאה מכך, הוספת חומצות שומן ישירות לתאים עלולה לא רק לגרום לספיגה תאית ירודה וזמינות נמוכה של תווית חומצת השומן, אלא גם ירידה במספר התאים המעשיים לניתוח במורד הזרם, כמו גם הפעלה של מסלולים מחוץ למטרה. עם זאת, פרוטוקולי תיוג מטבוליים רבים לזיהוי כימיית קליקים כרוכים בתוספת ישירה של חומצות שומן ומספר רב של מחקרי פלמיטויל-פרוטאום באמצעות זיהוי כימיה קליק עד כה לעתים רחוקות saponify תוויות חומצות שומן או לדגור אותם עם BSA8,36. חשוב לקחת בחשבון את העובדה כי היעילות והרגישות של זיהוי כימיה קליק של חלבונים שומן-acylated תלויים ספיגה תאית מספקת של אנלוגים חומצות שומן. לכן, סביר להניח כי חלבונים S-acylated רבים אולי נמלטו גילוי במחקרים פרוטאומיים בשל זמינות נמוכה של תוויות חומצות שומן משילוב לקוי לתוך התאים, במיוחד כאשר חומצת שומן שרשרת ארוכה יותר 17-ODYA שימש. 17-ODYA, או אלקיניל-סטארט, היה התווית הנפוצה של בחירה עבור מספר מחקרים בשל הזמינות המסחרית שלה ואת השימוש המוקדם שלה8,36. עם זאת, התוצאות של פרוטוקול זה ממחישות כי סאפוניפיקציה של 17-ODYA גורמת לעלייה הגדולה ביותר בזיהוי חלבונים S-acylated, בהשוואה לחומצות שומן קצרות יותר בשרשרת כגון פלמיטט או מיריסטט. לכן, חזרה על ניסויים אלה עם תוויות saponified עשוי להניב מצעים נוספים של S-acylation כי ייתכן שהתעלמו בעבר. יתר על כן, בעוד רוב palmitoyl acyltransferases מעדיפים palmitate עבור S-acylation, חלקם יש העדפות עבור אורכים אחרים של חומצות שומן כגון stearate15,38,44. בנוסף, חלבונים מסוימים או אפילו אתרים ספציפיים בתוך חלבונים מעדיפים חומצת שומן אחת על פני עוד 15,45. לכן, מחקרים באמצעות 17-ODYA עשוי להיות הטיה כלפי חלבונים S-acylated עם stearate, לא פלמיטט, תוך ייצוג חסר חלבונים אלה עקב גילוי נמוך יותר.
יעילות התיוג המטבולית המשופרת לכימיה של קליקים מסתמכת על סאפוניפיקציה של שומנים בדם ודגרה עם שלבי FAFBSA, כמו גם FBS המופרז. כל חומצות השומן חייב להיות saponified לחלוטין ב- KOH ללא מוצקים גלויים שנותרו לפני שתמשיך עם דגירה עם FAFBSA. זה יכול להיות צעד קשה ותזמון הוא קריטי. לאחר שחומצות השומן הספוניות נכנסו לתמיסה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, הוסיפו BSA חם מיד מכיוון שחימום נוסף יגרום לאידוי של DMSO מחומצות השומן. בנוסף, התווית saponified יתחיל להתמצק מחדש ברגע שהוא מתחיל להתקרר. לכן, FAFBSA חייב להיות חם והוסיף במהירות לאחר המלח הפך מסיס. בקבוקוני תגובת הזכוכית, וצורתם חשובים לשלב זה. הם מאפשרים את השומנים saponified להיות חם מספיק כדי להישאר מסיס, בעוד קריר מספיק כדי להבטיח כי FAFBSA אינו congeal. ערבוב מספיק באמצעות צינורות חשוב גם בשלב זה כדי להבטיח פתרון הומוגני לתיוג.
הריאגנטים לכימיה של קליקים צריכים להיות מאוחסנים כראוי, בדרך כלל עם חומרי ייבוש או תחת גז N2 או Ar ב -20 °C (60 °F) עד -80 °C (80 °F). חוסר אות acylation או אות חלש עשוי להיות בגלל ריאגנטים לא יציבים, במיוחד TBTA ישן יותר ופתרונות מלאי azide. יתר על כן, יש לנקוט בזהירות עם פתרונות מלאי אזיד פלואורסצנטיים, אשר צריך להיות מוגן מפני אור ככל האפשר. בנוסף, משתנים כגון שיטה של מניעת שומנים בדם וזמן תיוג ייתכן שיהיה צורך לבדוק כדי לקבוע את התנאים האופטימליים בהתאם לסוג התא המשמש. לדוגמה, תאים עצביים עשויים להזדקק זמני תיוג ארוכים יותר כי שינויים בתקשורת ומחסור בשומנים הם קשים (לא פורסם).
היתרון של פרוטוקול זה הוא הדרמטי ביותר כאשר נעשה שימוש בחומצות שומן ארוכות שרשרת. עבור שרשראות קצרות יותר, העלייה בעוצמת האות הופכת לפחות דרמטית, אך עדיין צפויה להגן על התאים. בעוד השינויים המוצעים ישפרו את זיהוי האצילציה חלבון באופן כללי, כימיה קליק עדיין נחשב שיטה ממוקדת שומנים1 מוגבלת לזיהוי של חלבונים דינמיים, לא S-acylated יציב1. מגבלות אחרות שיש לקחת בחשבון כוללות את הדרישה של חסך חומצות שומן כדי לקדם תיוג, ואת הטווח המוגבל יחסית של סוגי תאים תואמים בהשוואה לחילופי אציל ביוטין (ABE) זיהוי של S-acylation16. למרות מגבלות אלה, זיהוי כימיה קליק הוא מהיר יותר מאשר רוב בדיקות חילופי אציל והוא מתאים יותר לזיהוי חלבונים שאינם סובלים את שלבי משקעי חלבון חוזרים ונשנים הנדרשים לבדיקות חילופי אציל. בנוסף, גישה זו יכולה להיות משולבת עם תיוג סימולטני באמצעות בדיקות קליק אחרות כגון ניתוח מרדף דופק38.
השימוש בשינוי זה עבור תיוג מטבולי לכימיה קליק הגביר את הזיהוי הכולל של חלבונים acylated, במיוחד S-acylated, עם מגוון של טכניקות פרוטאומיות המשמשות בשילוב עם כימיה קליק. כפי שניתן לראות, זיהוי פלואורוגני יכול לשמש כחלופה לביוטין (איור 1)28. זה שימושי במיוחד כי אין חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגני בתא lysates. בנוסף, פלואורופורים המופעלים רק לאחר כימיה קליק ניתן להשתמש46. חומצת השומן הכפופה ל-FAFBSA לתיוג כימיה בלחיצה יכולה לסייע בקשיים בזיהוי חלבונים בעלי עניין עקב עלייה כוללת בכמות התווית הזמינה בתא ועל ידי הגבלת ההשפעות הרעילות של הוספת חומצות שומן ישירות לתקשורת. זה יכול גם להיות מנוצל בשילוב עם ספקטרומטריית מסה27 כדי להגביר את הזיהוי של חלבונים בשפע נמוך, במיוחד כאשר נלקח יחד עם ההתקדמות האחרונה באמצעות אלגוריתמים למידת מכונה המונעים מדידות מיותרות כדי להגביר את הרגישות לחלבונים בשפע נמוך, בניגוד לרכישה תלויית נתונים קיימת המעדיפה זיהוי של החלבונים הנפוצים ביותר47 . בנוסף, ניתן לשלב כימיה של קליק עם תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבית התאים (SILAC) ושיטות מרדף דופק כדי לייצר נתונים הניתנים לכימות על חלבון דינמי S-acylation27. לבסוף, קבוצת Hannoush שילבה כימיה קליק עם בדיקת קשירת קרבה (PLA) כדי לאפשר הדמיה של תא יחיד ובדיקות לתוך הפצה תת תאית של חלבונים palmitoylated43,48.

אסילציה שומנית כרוכה בתוספת קוולנטית של חומצות שומן לחלבונים והיא ידועה בחשיבותה בקידום אינטראקציות חלבון-קרום, אך הוכח גם כמקדם אינטראקציות חלבון-חלבון, שינויים קונפורמציה, ומווסת אתרים קטליטיים של אנזימים1,2,3,4,5,6,7 . אצילציה שומנית התגלתה כיעד פוטנציאלי לתרופה במספר עצום של מחלות, כולל זיהום, סרטן, דלקת, ניוון עצבי, שבו הפרעות palmitoylation תועדו8,9,10,10,11,12,13. זה כבר מונע בעיקר על ידי פיתוח של שיטות זיהוי כימיות חדשות, אשר אפשר זיהוי בקנה מידה גדול של מטרות חלבון S-acylated.
אסילציה שומנית יכולה לכלול מגוון רחב של שינויים הכרוכים בתוספת קוולנטית של חומצות שומן רוויות ובלתי רוויות, אך בדרך כלל מתייחס N-myristoylation ו- S-acylation. N-myristoylation מתייחס לתוספת של חומצה מיריסטית לגליצינים N-terminal או בתרגום משותף על פוליפפטידים המתהווה או לאחר תרגום על גליצינים N-מסוף שנחשפו לאחרונה בעקבות מחשוף פרוטאוליטי2,14. N-myristoylation מתרחשת באמצעות קשר אמיד בלתי הפיך. מצד שני, S-acylation מתייחס בדרך כלל לתוספת הפיכה של חומצות שומן ארוכות שרשרת לשאריות ציסטאין באמצעות קשר תיואסטר. הצורה הנפוצה ביותר של שינוי זה כוללת את השילוב של palmitate, ולכן, מכונה בדרך כלל S-palmitoylation, או פשוט palmitoylation11,15. במובנים רבים, S-palmitoylation דומה זרחן. זה דינמי, מוסדר אנזימטית, ומוכיח להיות מאוד מתיחה.
עד העשור האחרון, לימוד אצילות שומן הופרע על ידי שיטות זיהוי מוגבלות, אשר נדרשו רדיואקטיבית שכותרתו חומצות שומן. היו לכך מספר חסרונות, כולל עלות, בעיות בטיחות וזמני זיהוי ארוכים מאוד. בדרך כלל, דקל דקלים טריוטי או יוד שימש לגילוי של S-acylation16. פלמיטט tritiated נדרש תקופות זיהוי ארוכות עם סרט אוטורדיוגרפיה, אשר יכול לקחת שבועות עד חודשים. בעוד [125I] אנלוגים חומצות שומן iodo קיצרו את זמני הזיהוי, זה הציג סיכון בטיחותי גבוה בהרבה ונדרש ניטור קרוב של בלוטת התריס של הנסיינים. בנוסף, שיטות אלה היו לא כמותיות, ולכן, הגבלת היכולת למדוד palmitoylation דינמי, וגם זמן רב כדי להגדיר ולנקות בשל ציוד מגן אישי נוסף ניטור רדיואקטיבי. לבסוף, תוויות רדיואקטיביות לא היו מתאימות היטב למחקרים פרוטאומיים ובדרך כלל מוגבלות לזיהוי תפוקה נמוכה של חלבונים ספציפיים של עניין. ככל שזוהו יותר מצעים, ובאופן בלתי נמנע זוהו האנזימים המתווכים כל שינוי, היה ברור שנדרשות שיטות זיהוי חדשות 17,18,19,19,20,21. כמעט בו זמנית, מספר שיטות חדשות התעוררו לגילוי חלבונים acylated שומן. הראשון מנצל את ההפיכות והתגובה של קשר thioester של S-acylation. בדיקת חילופי אציל-ביוטין (ABE) מחליפה כימית את פלמיטט בביוטין למשיכת חלבונים S-acylated לאחר מכן באמצעות חרוזי אגרווז אבידין וזיהוי ישיר על ידי כתם מערבי22,23,24. לאחר מכן, פותחו תיוג ביו-אורתוגונלי של חומצות שומן ותוספת כימוסלקטיבית לתגים או ידיות שכללו את השימוש בקשירת Staudinger ולחץ על כימיה25,26,27,28,29,30,31,32,33 . לבסוף, בדומה ל- ABE, לכידת אציל-שרף בסיוע (RAC) למעשה מחליף אתרים S-acylated עם חרוזים תגובתי תיול ללכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated34,35. יחד, הבדיקות המבוססות על החלפה וכימיה של קליקים סיפקו שיטות יעילות ורגישות יותר של גילוי אסילציה וטיהור זיקה לניתוח במורד הזרם, ולאחר מכן הובילו לגילוי אלפי חלבונים S-acylated8,36.
המונח כימיה קליק מקיף קבוצה של תגובות כימיות, אבל בדרך כלל מתייחס Cu(I)-מזורז אזידו-alkyne [3+2] cycloaddition תגובה מנגנון בין קבוצת אלקיניל וקבוצת אזידו227,28,37. במיוחד, במקרה של acylation שומן, כימיה קליק כרוך בזיהוי S-palmitoylation או N-myristylation על ידי שילוב ביו-אורתוגונל 16-פחמן אלקיניל-פלמיטט (15-hexadecynoic חומצה; 15-HDYA) או 14-פחמן אלקיניל-myristate (13-טטראדצינואית חומצה; 13-TDYA), בהתאמה, לתאים לתייג חלבונים אציליים אנדוגניים28 . לאחר תמוגת תאים ואימונופרציפציה של חלבון העניין, תגובה כימית קליק (קישור קוולנטי בין אלקין ואזיד) מבוצעת כדי לאגד גשוש זיקה, בדרך כלל ביוטין, לגילוי על ידי blot המערבי28,37. לחלופין, כימיה קליק יכול להתבצע על סך lysate התא חלבונים acylated שומן יכול להיות מטוהר לזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה. תגובת הכימיה הראשונית של הקליק עם אזידו-ביוטין הגדילה את הסלקטיביות והרגישות של הזיהוי יותר ממיליון פעמים בהשוואה לרדיואקטיביות2. יתרון נוסף של כימיה קליק הוא שזה יכול להיות משולב עם שיטות תיוג קלאסיות אחרות, כגון ניתוח דופק-מרדף של מחזור חלבון באמצעות אזידו-הומואלנין לניתוח כמותי38. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקות פלואורסצנטיות במקום בביוטין או בבדיקות ביוכימיות אחרות, כגון תגי FLAG או Myc, על מנת לבחון לוקליזציה של חלבון16,28,39.
למרות הקלות היחסית של השימוש בכימיה קליק, זיהוי יכול להיות מוגבל על ידי מסיסות נמוכה רעילות פוטנציאלית של שימוש בחומצות שומן ללא שרשרת ארוכה בתרבית התא40. בפרט, למרות ההעדפה של פלמיטט במהלך S-acylation עבור רוב החלבונים, מחקרים רבים השתמשו 18-פחמן stearate (17-אוקטדיצינואית חומצה - 17-ODYA) ולא פלמיטט (15-HDYA) לאיתור חלבונים S-acylated בשל הזמינות המסחרית שלה ועלות נמוכה יחסית. עם זאת, 17-ODYA הוא מאוד מסיס ודורש תשומת לב מיוחדת בעת שימוש. בנוסף, כימיה קליק יכול לדרוש כמה הכנה ניואנסים ואחסון של כימיקלים. בזאת, הפרוטוקול מתאר גישה תיוג, אשר מייעל את המסירה באמצעות saponification של חומצות שומן, משלוח עם BSA ללא חומצות שומן, וסרום בקר עוברי delipideded (FBS) כדי להגדיל את המסיסות ולעקוף השפעות רעילות פוטנציאליות של הוספת חומצות שומן חופשיות לתאים28. שיטה זו פועלת במגוון סוגי תאים ואף שימשה בבעלי חיים28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

אסילציה שומנית, התוספת הקוולנטית של חומצות שומן רוויות למצעי חלבון, חשובה בוויסות מספר עצום של פונקציות תאיות בנוסף להשלכותיה בסרטן ובמחלות ניווניות. ההתפתחויות האחרונות בשיטות זיהוי אסילציה שומנית אפשרו זיהוי יעיל ולא מסוכן של חלבונים עתירי שומן, במיוחד באמצעות שימוש בכימיה של קליקים עם תיוג ביו-אורתוגונלי. עם זאת, זיהוי כימיה קליק יכול להיות מוגבל על ידי מסיסות לקויה והשפעות רעילות פוטנציאליות של הוספת חומצות שומן שרשרת ארוכה לתרבות התא. מתואר כאן היא גישת תיוג עם משלוח ממוטב באמצעות חומצות שומן saponified בשילוב עם BSA ללא חומצות שומן, כמו גם מדיה delipidated, אשר יכול לשפר את הזיהוי של חלבונים acylated שומן קשה לזהות. אפקט זה היה בולט ביותר עם אנלוגי אלקיניל-סטארט, 17-ODYA, אשר היה אנלוגי חומצת השומן הנפוצה ביותר בזיהוי כימיה קליק של חלבונים אציליים. שינוי זה ישפר את התאגדות התאים ויגביר את הרגישות לזיהוי חלבונים מצולק. בנוסף, גישה זו יכולה להיות מיושמת במגוון סוגי תאים בשילוב עם בדיקות אחרות כגון ניתוח מרדף דופק, תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבית התאים, ספקטרומטריית מסה עבור פרופיל כמותי של חלבונים אסילציה שומן.

ניתן לדמיין את ההבדל ביעילות התיוג בין חומצות שומן אלקיניל סאפוניות ולא-סאפוניות (שאינן sap) לזיהוי כימיה של קליקים ולהשוות אותות לעוצמת האות של חלבונים עתירי שומן באמצעות כתם מערבי (איור 1). השפעה ניכרת נצפתה עם אורך הולך וגדל של שרשראות אציל. בתאים המסומנים באלקיניל-סטארט (alk-stear), סאפוניפיקציה של חומצת השומן ואספקה עם BSA לתיוג מטבולי הגבירו באופן דרסטי את הזיהוי של אות חלבון S-acylated באמצעות כימיה וזיהוי קליקים על ידי בדיקת אזידו פלואורסצנטית (איור 1, מימין), דבר המצביע על עלייה כוללת בשילוב התאי של תווית חומצת השומן אלקיניל. לעומת זאת, לא נצפתה הבדל ניכר בתאים שטופלו בחומצת השומן הקצרה והמסיסה ביותר, אלקיניל-מיריסטט (אלקיניל-מאייר; 13-חומצה טטרדצינואית או 13-TDYA). תאים המסומנים באלקיניל-פלמיטט (איור 1, אמצע) הראו עלייה בינונית בתווית בהשוואה לאלקיניל-מיריסטט (13-TDYA), אך פחות מאלקיניל-סטארט.
חשוב לציין, טיפול בממברנות PVDF עם 0.1 M KOH הסיר במידה רבה את תוויות חומצות השומן מתאים שנדגרו עם אלקיניל-פלמיטט ואלקיניל-סטארט, המאשר כי רוב האות היה באמצעות קשר אסתר או תיאסטר (איור 1, אמצע וימין, לוחות תחתון). כצפוי, השילוב של אלקיניל-מיריסטט היה בעיקר עמיד בפני אלקלי (איור 1, שמאל, לוחות תחתונים), בשל החיבור של מיריסטט לחלבונים באמצעות קשר אמיד.
איור 2 מדגים את הרב-תכליתיות והרגישות של כימיית קליקים כדי לזהות אצילות שומנית של חלבונים אימונו-פחתיים. תאי HEK293T הודבקו עם ציד C-מסוף מיריסטוylated (HTT) הותך GFP (myr-ctHTT-GFP) ומסומן עם אלקיניל-מיריסטט, כפי שתואר בעבר18. לאחר immunoprecipitation, ctHTT-GFP שוחרר מן החרוזים והיה נתון לכימיה קליק לצד lysates. לא רק שהמיריסטוילציה של wildtype (WT) myr-ctHTT-GFP זוהתה באימונופרציפיטים, אלא שהיא זוהתה מאוד בליסטים, בעוד המוטציה G2A חסמה לחלוטין מיריסטוילציה של ctHTT-GFP (איור 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> איור 1: זיהוי חלבונים עתירי שומן באמצעות כימיה של קליקים. תאי HEK293T דוגרו עם חומצות השומן המצוינות ישירות (ללא SAP) או בעקבות סאפוניפיקציה (sap) ודגרה עם חלבון הנושא BSA, כמתואר בפרוטוקול 2.1-2.7. חומצות שומן אלקיניל קושרו אזיד פלואורסצנטי על ידי חשיפת 100 מיקרוגרם של ליסטים חלבון ללחוץ על כימיה, מופרדים על ידי SDS-PAGE, והועברו לממברנות PVDF. לאחר טיפול עם 0.1 M Tris pH 7.0 או 0.1 M KOH, כדי להפוך את קשרים thioester, acylation שומן זוהה באמצעות אזיד פלואורסצנטי. GAPDH שימש כפקד טעינה; רודמין נגד GAPDH (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> איור 2: זיהוי של ctHTT-GFP N-myristoylated באמצעות כימיה של קליקים. תאי HEK293T הועברו עם C-סופני חתוך (ct) וצורה myristoylatable של HTT (myr-ctHTT-GFP) ומסומנים עם אלקיניל-מיריסטט. צורה שאינה ניתנת למיריסטואולציה עם הגליצין החיוני שהוחלף באלנין נכללה (G2A). לאחר קציר וליזה, ctHTT-GFP היה immunoprecipitated באמצעות עז אנטי GFP. Lysates היו נתונים לתגובת כימיה קליק (משמאל) כמו גם immunoprecipitates לאחר שחרור מן החרוזים. Myristoylation זוהה באמצעות Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP זוהה באמצעות ארנב אנטי GFP בשילוב עם אנטי ארנב Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> איור 3: ערכת זרימת עבודה של פרוטוקול ניסיוני. חלוקה לרמות של זרימת עבודה של השלבים הניסיוניים העיקריים בפרוטוקול. מספר נקודות נרשמות כאשר הפרוטוקול עשוי להיות מושהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

שיטה זו משפרת את המסירה של חומצות שומן לתאים ומגנה עליהם מפני ההשפעות הרעילות של אספקת חומצות שומן חופשיות, ובכך מבטיחה תיוג עקבי יותר. הרגישות והיעילות של זיהוי כימיית קליקים תלויות בספיגה היעילה של תווית חומצת השומן. הראינו שניתן לשפר זאת במידה רבה.מספר שלבים של הפרוטוקול הם ספציפיים מאוד ויש לעקוב אחריהם מקרוב. הדגמה חזותית יכולה להבהיר ולהראות, למשל, כיצד להימנע מהיווצרות מוצקים בתמהיל התוויות. כדי להכין את מדיה תיוג, להשלים DMEM עם 5% dextran / פחם מצופה FBS, 1X פניצילין סטרפטומיצין, שני מילימולרי L-גלוטמין, ו 100 מילימולרי נתרן פירובט, ולאחר מכן לפני לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.שטפו בעדינות את תאי ה-T של HEK-293 שציפו יום אחד קודם לכן בצלחת תרבית של שש בארות רקמות עם PBS, ולאחר מכן החליפו את ה-PBS במדיה עם תיוג. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך כ 45 דקות לפני שתמשיך תיוג מטבולי עם חומצות שומן. כדי saponify אנלוגים חומצת שומן, פיפטה לפחות שני microliters של חומצת שומן אלקיניל אנלוגי ישירות לתחתית בקבוקון תגובה חרוטית שלושה מיליליטר.פיפטה כמות שווה של אשלגן הידרוקסיד מדולל קרוב לתחתית בקבוקון התגובה על קצה הזכוכית, כך נפח מחולק של אשלגן הידרוקסיד מתערבב עם חומצת השומן. סגור את המכסה של הבקבוקון והקש בעדינות כדי לערבב את הפתרונות. מחממים את בקבוקון התגובה ב 65 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות או עד הפתרון מתבהר, המציין כי חומצת השומן שולבה.עם זאת, יש לדאוג כי הנוזל אינו מתאדה יותר מדי. לאחר מכן, פיפטה התחמם מראש 20% חומצות שומן ללא BSA כך יחס נפח של חומצות שומן אשלגן הידרוקסיד כדי BSA ללא חומצות שומן הוא 1-1-50, השגת ריכוז סופי של 20X חומצות שומן אלקיניל קשורות BSA. מערבבים את התמיסה על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולאחר מכן לדגור אותו במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.תייג את תאי ה-T של HEK-293 על-ידי הוספת חומצת השומן BSA 20X מצומדת ישירות למדיית הרעב כדי להשיג ריכוז סופי של 1%BSA ב-25 מיקרומולרי אלקיניל מיריסטט או 100 מיקרומולרי אלקיניל פלמיטט ואלקיניל סטארט. לשם השוואה, להוסיף נוזלים שאינם saponified על ידי צינור שני microliters של חומצת שומן ללא תווית ישירות לתוך התקשורת רעב, ולאחר מכן למקם את התאים בחזרה לתוך האינקובטור במשך שלוש עד שש שעות. לאחר השלמת הדגירה, לשטוף בעדינות את התאים עם PBS בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לקצור וליז את התאים על ידי הוספת 500 microliters EDTA חינם שונה מאגר RIPA וסיבוב lysates במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה lysates ב 16, 000 כפול G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאסוף את supernatant ב 1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. הביאו 50 עד 100 מיקרוגרם של ליסט חלבון בצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.7 מיליליטר לנפח שווה באמצעות מאגר RIPA שונה ללא EDTA. שמור על עוצמת התגובה קטנה ככל האפשר.הוסף STS לכל דגימה כדי להשיג ריכוז סופי של 1%הכן תערובת ראשית של ריאגנטים קליקים והוסף אמצעי אחסון מתאימים לליסטים, ולאחר מכן ערבוב על-ידי צנרת למעלה ולמטה. לדגור על lysates בחושך במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מדי פעם. עבור immunoprecipitation, לערבב lysates עם ארנב אנטי GFP ודגור לילה עם סיבוב בארבע מעלות צלזיוס.הוסף 15 עד 20 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מראש שיווי משקל עם 0.1% SDS RIPA לכל צינור ולאפשר לו להגיב סוף סוף בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לשטוף את החרוזים עם מאגר תמוגה resuspend ב 45 microliters של 50 מילימולר HEPES חיץ המכיל 1%SDS. מחממים את החרוזים ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.במהלך הדגירה, להפוך או להסעיר את הצינורות בערך כל חמש דקות, ואז לסובב בקצרה את כל הצינורות. בעוד הדגימות עדיין חמות, לאסוף את supernatant המכיל את החלבונים. שלבו 43 מיקרוליטרים של הסופר-נרטיב עם שבעה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר ריאגנטים קליקים ואפשרו להם להגיב בחושך במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.בעלילה מערבית, נצפתה השפעה ניכרת ביעילות התיוג לגילוי כימיה קליק בין חומצות שומן אלקיניל סאפוניזציה ולא סאפון עם אורך הולך וגדל של שרשראות אציל. בתאים המסומנים עם אלקיניל סטארט, סאפוניפיקציה של חומצת השומן ואספקה עם BSA עבור תיוג מטבולי הגדיל באופן דרסטי את הזיהוי של אות חלבון S-acylated באמצעות כימיה קליק וזיהוי על ידי azitoprobe פלואורסצנטי, מציע עלייה כוללת שילוב תאי של תווית חומצת השומן אלקיניל. לעומת זאת, לא נצפתה הבדל ניכר בתאים שטופלו בחומצת השומן הקצרה והמסיסה ביותר אלקיניל מיריסטט.תאים המסומנים באלקיניל פלמיטט הראו עלייה בינונית בתווית בהשוואה לאלקיניל מיריסטט, אך פחות מאלקיניל סטארט. חשוב לציין, טיפול של ממברנות PVDF עם 0.1 טוחנת אשלגן הידרוקסיד הסיר במידה רבה את תוויות חומצת השומן מתאים דגירה עם אלקיניל פלמיטט ואת אלקיניל סטארט, המאשר כי רוב האות היה באמצעות קשר אסתר או thioester. כצפוי, השילוב של אלקיניל מיריסטט היה בעיקר אלקלי עמיד בשל הקשר של myristate לחלבונים באמצעות קשר אמיד.בעקבות כימיה קליק, myristoylation של סוג פראי myristoylated C-מסוף הנטינגטון GFP זוהה immunoprecipitates, כמו גם lysates, בעוד מוטציית G2A חסמה לחלוטין מיריסטוylation של C-מסוף הנטינגטון GFP. בעקבות כימיה קליק, אנו יכולים לבצע טיהור זיקה של חלבונים acylated שומן עבור ספקטרומטריית מסה. זה עשוי להניב פרופיל שונה של חלבונים acylated שומן על ידי הגנה על תאים מפני רעילות.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

Abstract