Enkeltmolekyle opholdstidsanalyse af restriktionsendonuklease-medieret DNA-spaltning

Dette nye totale interne refleksionsfluorescensmikroskopi-baserede assay letter samtidig måling af længden af den katalytiske cyklus for hundredvis af individuelle restriktionsendonukleasemolekyler (REase) i et eksperiment. Denne analyse kræver ikke proteinmærkning og kan udføres med en enkelt billedbehandlingskanal. Derudover kan resultaterne af flere individuelle eksperimenter samles for at generere veludfyldte dvel-dwell-time-fordelinger. Analyse af de resulterende opholdstidsfordelinger kan hjælpe med at belyse DNA-spaltningsmekanismen ved at afsløre tilstedeværelsen af kinetiske trin, der ikke kan observeres direkte. Eksempeldata indsamlet ved hjælp af dette assay med den velundersøgte REase, EcoRV - en dimer Type IIP-restriktionsendonuklease, der spalter den palindromiske sekvens GAT↓ATC (hvor ↓ er skærestedet) - er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. Disse resultater tyder på, at der er mindst tre trin i vejen til DNA-spaltning, der initieres ved at introducere magnesium, efter at EcoRV binder DNA i dets fravær, med en gennemsnitlig hastighed på 0,17 ^s-1 for hvert trin.