Este trabalho foi apoiado por bolsas da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (17H05007 e 18H05491) para MT, da Fundação Nacional de Ciência (IOS1557899 e MCB2016177) e da Administração Nacional de Aeronáutica e Espaço (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) para a SG.

1. Preparação do material vegetal
<ol><li>Em um microtubo de 1,5 mL, a superfície esteriliza as sementes de Arabidopsis thaliana (adesão Col-0) expressando gCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR tremendo com 20% (v/v) NaClO por 3 min e depois lave 5 vezes com água destilada estéril. NOTA: As linhas transgênicas de Arabidopsis expressando GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR foram descritas anteriormente6.</li>
	<li>Em um capô estéril, semeear 13 sementes esterilizadas pela superfície em uma p...

A sinalização sistêmica é importante para que as plantas respondam a estímulos ambientais externos localizados e, em seguida, mantenham sua homeostase em todo o nível da planta. Embora não estejam equipados com um sistema nervoso avançado como animais, eles empregam comunicação rápida dentro e entre órgãos com base em fatores como sinais elétricos móveis (e possivelmente hidráulicos) e ondas propagadoras de ROS e Ca2+ 46,47. O protocol...

As plantas não podem escapar de estresses bióticos, por exemplo, insetos que se alimentam deles, por isso desenvolveram sofisticados sistemas de sensoriamento de estresse e transdução de sinais para detectar e, em seguida, proteger-se de desafios como herbívoro1. Ao ferir ou atacar herbívoros, as plantas iniciam respostas rápidas de defesa, incluindo o acúmulo do ácido jasmônico fitohormônio (JA) não apenas no local ferido, mas também em órgãos distais não danificados2. Este JA então ambos desencadeiam respostas de defesa nos tecidos diretamente danificados e induz preventivamente defesas nas partes não danificadas da planta. Em Arabidopsis, o acúmulo de JA induzido pelo ferimento foi detectado em folhas distais e intactas em apenas alguns minutos de danos em outros lugares da planta sugerindo que um sinal rápido e de longa distância está sendo transmitido da folha3ferida . Vários candidatos, como ca2+,espécies reativas de oxigênio (ROS) e sinais elétricos, foram propostos para servir como esses sinais de ferida de longa distância nas plantas4,5.
Ca2+ é um dos mais versáteis e onipresentes segundo elementos mensageiros em organismos eucarióticos. Nas plantas, a mastigação de lagartas e o ferimento mecânico causam aumentos drásticos na concentração citosolic Ca2+ ([Ca2+]cyt) tanto na folha ferida quanto em folhas distantes desenroladas6,7. Este sinal sistêmico Ca2+ é recebido por proteínas de sensoriamento intracelular Ca2+,que levam à ativação de vias de sinalização de defesa a jusante, incluindo a biossíntese JA8,9. Apesar de inúmeros desses relatos que sustentam a importância dos sinais de Ca2+ nas respostas de feridas vegetais, as informações sobre as características espaciais e temporais dos sinais Ca2+ induzidos pelo ferimento são limitadas.
A imagem em tempo real usando indicadores Ca2+ geneticamente codificados é uma ferramenta poderosa para monitorar e quantificar a dinâmica espacial e temporal dos sinais Ca2+. Até o momento, foram desenvolvidas versões desses sensores que permitem a visualização de sinais ca2+ ao nível de uma única célula, para tecidos, órgãos e até plantas inteiras10. O primeiro biosensor geneticamente codificado para Ca2+ usado em plantas foi a proteína bioluminescente aequorin derivada da água-viva Aequorea victoria11. Embora esta proteína quemiluminescente tenha sido usada para detectar alterações de Ca2+ em resposta a várias tensões nas plantas12,13,14,15,16,17,18, não é adequada para imagens em tempo real devido ao sinal extremamente baixo luminescente que produz. Os indicadores Ca2+ baseados em Förster Resonance Energy Transfer (FRET), como os cameleons Amarelos, também foram usados com sucesso para investigar a dinâmica de uma gama de eventos de sinalização Ca2+ nas usinas19,20,21,22,23,24. Estes sensores são compatíveis com abordagens de imagem e, mais comumente, são compostos pela proteína de ligação Ca2+ calmodulin (CaM) e um peptídeo de ligação de CaM (M13) de uma quinase da cadeia de luz da miosina, tudo fundido entre duas proteínas fluorforas, geralmente uma Proteína Fluorescente Cyan (CFP) e uma variante de Proteína Fluorescente Amarela (YFP)10. A ligação Ca2+ ao CaM promove a interação entre CaM e M13 levando a uma mudança conformacional do sensor. Essa mudança promove a transferência de energia entre o PCP e o YFP, o que aumenta a intensidade da fluorescência do YFP, diminuindo a emissão de fluorescência do PCP. O monitoramento dessa mudança de CFP para fluorescência YFP fornece então uma medida do aumento do nível Ca2+. Além desses sensores FRET, biosensores ca2+ baseados em proteína única (FP) como GCaMP e R-GECO, também são compatíveis com abordagens de imagem vegetal e são amplamente utilizados para estudar as alteraçõesde citos [Ca2+] devido à sua alta sensibilidade e facilidade de uso25,26,27,28,29,30. Os GCaMPs contêm um único GFP circularmente permutado (cp), novamente fundido ao CaM e ao peptídeo M13. A interação dependente de Ca2+entre CaM e M13 provoca uma mudança conformacional no sensor que promove uma mudança no estado de protonação do cpGFP, aumentando seu sinal fluorescente. Assim, à medida que os níveis de Ca2+ aumentam, o sinal cpGFP aumenta.
Para investigar a dinâmica dos sinais ca2+ gerados em resposta a ferimentos mecânicos ou alimentação herbívora, utilizamos plantas transgênicas arabidopsis thaliana expressando uma variante GCaMP, GCaMP3, e um microscópio de fluorescência de campo largo6. Esta abordagem conseguiu visualizar a transmissão rápida de um sinal Ca2+ de longa distância do local da ferida em uma folha para toda a planta. Assim, um aumento nocite [Ca2+] foi imediatamente detectado no local da ferida, mas este sinal Ca2+ foi então propagado para as folhas vizinhas através da vasculatura poucos minutos após o ferimento. Além disso, descobrimos que a transmissão desse sinal de ferida sistêmica rápida é abolida em plantas arabidopsis com mutações em dois genes semelhantes a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.66. Os GLRs parecem funcionar como canais de aminoácidos fechados Ca2+ envolvidos em diversos processos fisiológicos, incluindo resposta à ferida3,crescimento do tubo de pólen31,desenvolvimento raiz32,resposta fria33e imunidade inata34. Apesar dessa função fisiológica bem compreendida e ampla das GLRs, as informações sobre suas propriedades funcionais, como sua especificidade de ligante, seletividade de íons e localização subcelular, são limitadas35. No entanto, estudos recentes relataram que GLR3.3 e GLR3.6 estão localizados nos phloem e xilem, respectivamente. As GLRs vegetais têm semelhanças com receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs)36 em mamíferos, que são ativados por aminoácidos, como glutamato, glicina e D-serina no sistema nervoso mamífero37. De fato, demonstramos que a aplicação de glutamato de 100 mM, mas não outros aminoácidos, no local da ferida induz um sinal ca2+ rápido e de longa distância em Arabidopsis,indicando que o glutamato extracelular provavelmente age como sinal de ferida nas plantas6. Esta resposta é abolida no mutante glr3.3/glr3.6 sugerindo que o glutamato pode estar agindo através de um ou ambos esses canais semelhantes a receptores e, de fato, o AtGLR3.6 foi recentemente mostrado como fechado por esses níveis de glutamato38.
Nas plantas, além de seu papel como aminoácido estrutural, o glutamato também foi proposto como um importante regulador de desenvolvimento39; no entanto, sua dinâmica espacial e temporal são mal compreendidas. Assim como no Ca2+, vários indicadores geneticamente codificados para glutamato foram desenvolvidos para monitorar a dinâmica deste aminoácido em células vivas40,41. IGluSnFR é um biosensor de glutamato uni FP baseado em GFP composto por cpGFP e uma proteína de ligação de glutamato (GLT) da Escherichia coli42,43. A mudança conformacional do iGluSnFR, que é induzido pela ligação de glutamato ao GLI, resulta em uma emissão de fluorescência GFP aprimorada. Para investigar se o glutamato extracelular age como uma molécula de sinalização na resposta à ferida vegetal, conectamos a sequência iGluSnFR com a sequência básica de secreção de peptídeo de sinal de chitinase (CHIB-iGluSnFR) para localizar esse biosensor no espaço apoplásico6. Esta abordagem permitiu a imagem de quaisquer alterações na concentração de glutamato apoplástico ([Glu]apo) usando plantas de Arabidopsis transgênicas expressando este sensor. Detectamos aumentos rápidos no sinal iGluSnFR no local do ferimento. Esses dados apoiam a ideia de que o glutamato vaza das células/tecidos danificados para o apoplasto ao ferimento e age como um sinal de dano ativando as GLRs e levando ao sinal Ca2+ de longa distância nas plantas6.
Aqui, descrevemos um método de imagem em tempo real em toda a planta usando biosensores geneticamente codificados para monitorar e analisar a dinâmica dos sinais de glutamato Ca2+ de longa distância e extracelulares em resposta ao ferimento6. A disponibilidade de microscopia de fluorescência de campo amplo e plantas transgênicas expressando biosensores geneticamente codificados fornece uma abordagem poderosa, mas facilmente implementada para detectar sinais de longa distância rapidamente transmitidos, como ondas ca2+.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td>
			<td>Saitama University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamate</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>072-00501</td>
			<td>Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>392-00591</td>
			<td>composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ25 stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR analysis</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plastic Petri dish</td>
			<td>Simport</td>
			<td>D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field, real-time imaging of local and systemic wound signals in arabidopsis

As plantas respondem a tensões mecânicas, como ferimentos e herbívoros, induzindo respostas de defesa tanto nas partes danificadas quanto nas partes distais não danificadas. Após o ferimento de uma folha, ocorre um aumento na concentração de íons de cálcio citosos (sinal ca2+) no local da ferida. Este sinal é rapidamente transmitido para folhas não danificadas, onde as respostas de defesa são ativadas. Nossa pesquisa recente revelou que o glutamato vazando das células feridas da folha para o apoplasto ao seu redor serve como um sinal de ferimento. Este glutamato ativa os canais permeáveis ca2+ semelhantes ao receptor de glutamato, o que leva à propagação de sinal Ca2+ de longa distância em toda a planta. As características espaciais e temporais desses eventos podem ser capturadas com imagens em tempo real de plantas vivas expressando biosensores fluorescentes geneticamente codificados. Aqui introduzimos um método de imagem em tempo real em toda a planta para monitorar a dinâmica dos sinais ca2+ e mudanças no glutamato apoplástico que ocorrem em resposta ao ferimento. Esta abordagem usa um microscópio de fluorescência de campo largo e plantas de Arabidopsis transgênicas expressando Ca2+ à base de Proteína Fluorescente Verde (GFP) e biosensores de glutamato. Além disso, apresentamos metodologia para facilmente provocar a propagação de sinal Ca2+ induzida por feridas e glutamato. Este protocolo também pode ser aplicado a estudos sobre outras estações vegetais para ajudar a investigar como a sinalização sistêmica da planta pode estar envolvida em suas redes de sinalização e resposta.

A propagação de sinais de [Ca2+]cyt e [Glu]apo em resposta ao ferimento é apresentada na Figura 3, Figura 4, Filme S1e Filme S2. Cortar a petiola da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 (em 0 s) levou a um aumento significativo nocite [Ca2+] que foi rapidamente induzido localmente através da vasculatura (aos 40 s) (F...

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Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

A sinalização sistêmica de cálcio acionada por glutamato extracelular é fundamental para a indução de respostas de defesa vegetal a ferimentos mecânicos e ataque herbívoro em plantas. Este artigo descreve um método para visualizar a dinâmica espacial e temporal de ambos os fatores usando plantas arabidopsis thaliana expressando biosensores fluorescentes sensíveis ao cálcio e glutamato.

Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Este protocolo permite imagens em tempo real da atividade do sistema de sinalização sistêmica da planta através do monitoramento da dinâmica do cálcio e glutamato apoplástico em resposta ao ferimento. Este método de imagem em tempo real de toda a planta fornece uma ferramenta robusta para entender a dinâmica dos sinais de rápida e longa distância nas plantas, combinando uma alta resolução temporal espacial e facilidade de uso. Este protocolo oferece o potencial de fornecer uma nova visão das características espaciais e temporais do sistema de sinalização de cálcio em respostas ao estresse biótico e abiótico em outras espécies de plantas.Demonstrando o procedimento será Takuya Uemura, bolsista de pós-doutorado do meu laboratório. Comece ligando o microscópio estéreo fluorescente motorizado, equipado com uma lente objetiva 1X e uma câmera sCMOS. Configure as configurações do dispositivo para irradiar com luz de excitação centrada em 470 nanômetros, selecionadas usando um filtro que transmite luz entre 450 e 490 nanômetros.Adquira luz de emissão usando um filtro que transmite entre 510 e 560 nanômetros. Retire a tampa do prato que contém a planta e coloque-a sob a lente objetiva. Verifique o sinal fluorescente da planta.Em seguida, aguarde aproximadamente 30 minutos no escuro até que as plantas sejam adaptadas às novas condições ambientais. Ajuste o foco e a ampliação para ver toda a planta no campo de visão. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição para detectar os sinais fluorescentes usando o software de imagem dos microscópios.Defina o tempo de gravação para 11 minutos. Imagem por cinco minutos antes de iniciar o experimento para aclimatar a planta à irradiação de luz azul a partir do microscópio, em seguida, começar a gravar. Para determinar a fluorescência média da linha de base, regisso pelo menos 10 quadros antes da aplicação do ferimento ou glutamato.Para imagens em tempo real de íon citosolico de cálcio induzido pela ferida e alterações na concentração de glutamato apoplástico, corte a petiola ou a região média da folha L1 com uma tesoura. Para a imagem em tempo real de glutamato desencadeou alterações citosóicas de cálcio, corte aproximadamente um milímetro da ponta da folha L1 através da veia principal com a tesoura. Após pelo menos 20 minutos aplique 10 microlitadores de 100 mililitros de glutamato na superfície cortada da folha.Para análise de intensidade de fluorescência ao longo do tempo, defina uma região de interesse no local onde a intensidade da fluorescência deve ser analisada. Defina dois ROIs para o cálculo de velocidade da onda de cálcio. No software de imagem clique na medição de tempo, defina e circule.Meça a distância entre as duas regiões clicando em anotações e medição, comprimento e linha simples. Meça os valores de floresnce brutos em cada ROI ao longo do tempo clicando na medida e, em seguida, exporte os dados brutos para o software de planilha, para converter o sinal fluorescente em números em cada ponto de tempo. Determinar o valor da fluorescência da linha de base, que é adivinhado como F zero, calculando a média F sobre os primeiros 10 quadros nos dados registrados, e então normalizar os dados F conforme descrito no manuscrito do texto.Para a análise da onda de velocidade de cálcio, defina um ponto de elevação significativo do sinal acima dos valores pré-estimulados como representando a detecção de um aumento de cálcio em cada ROI. Calcule a diferença de tempo no aumento do cálcio entre os dois ROIs e a distância entre eles para determinar as velocidades de qualquer onda de cálcio. A propagação de uma mudança desencadeada pela ferida nas concentrações do íon citosolico de cálcio e glutamato apoplástico é mostrada aqui.Cortar a petiole de uma folha em plantas expressando GCaMP-3 levou a um aumento significativo no cálcio. Foi induzido localmente e depois se espalhou por toda a vasculatura. O sinal foi rapidamente propagado para folhas vizinhas em poucos minutos.Ao cortar uma folha e plantas expressando chitinase básica eu cola sniffer, observou-se um rápido aumento de glutamato apoplásico ao redor da região de corte. Em poucos minutos, o sinal também se propagou através da vasculatura. Para a imagem em tempo real da propagação do sinal de cálcio desencadeada pela aplicação do glutamato, a borda de uma folha em plantas expressando CCaMP-3 foi cortada.Isso causou um aumento da concentração de íons de cálcio citosocos locais, mas o sinal desapareceu em poucos minutos. Após aproximadamente 10 minutos, o glutamato foi aplicado na superfície cortada, causando um rápido aumento local na concentração de cálcio citosolico e, em seguida, propagação deste sinal para folhas distais. Para medir as mudanças dentro de uma concentração de cálcio sólida induzida pelo ferimento na folha sistêmica, a mudança de curso de tempo da intensidade do sinal GCaMP-3 foi medida em duas regiões de interesse.Também foram medidas as mudanças de concentração de glutamato apoplástico em resposta a danos mecânicos. A assinatura do glutamato exibiu um único pico em aproximadamente 100 segundos após o ferimento. Este experimento deve ser realizado sob condições controladas por temperatura e umidade, pois são elevados por mudanças nestas condições ambientais.Este protocolo oferece um potencial para fornecer insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes à sinalização de longa distância através do uso de mutantes que os elementos defeituosos e putativos do sistema de sinalização de laboratório.