עבודה זו נתמכה על ידי NIH R15-HL135675-01 ו- NIH 2 R15-HL135675-02 ל- T.J.L.

1. הכינו מאגרים וריאגנטים
<ol><li>הכינו פתרונות טריים של מעכבי פוספטאז ופרוטאז.<ol><li>הוסיפו 17.4 מ"ג של פנילמתנסולפוניל פלואוריד (PMSF) ל-1 מ"ל של 100% אתנול כדי להכין ציר של 100 mM. הערה: יש ללבוש ציוד מגן בעת טיפול בתסמונת קדם-וסתית, שכן הוא מסוכן בבליעה או בשאיפה ובמגע עם העור או העיניים. זה קורוזיבי לע...

<ol>
	<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, 440-445 (2015).</li><li>Il Hwang, S., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers:+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility.">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li><li>Clayton, D. A., Shadel, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues.">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).</li><li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses.">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses.</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li><li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels.">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li><li>Therien, A. G., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology.">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAPDH+as+a+housekeeping+gene:+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues.">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li><li>Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformations+and+interactions+of+histones+and+their+role+in+chromosome+structure.">Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).</li><li>McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+of+U937+cells+in+the+absence+of+high-speed+centrifugation.">Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).</li><li>McCaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis.">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).</li></ol>

שיטה זו היא גרסה שונה של גישה שפורסמה בעבר לפיצול תת-תאי ללא שימוש בצנטריפוגהבמהירות גבוהה 11. שיטה שונה זו דורשת ציוד מיוחד יותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, אך היא מקיפה יותר וניתנת לשחזור באופן עקבי.
פיתוח הפרוטוקול הראשוני היה הכרחי בשל חוסר יכולת להפר?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1 
Timothy LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62119">Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Keven J. Hughes1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1 
Matthew A. Deragon1 
Phillip V. Truong1 
Angeleigh R. Knapp1 
Timothy J. LaRocca1 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

פיצול תת-תאי הוא הליך שבו תאים שוכבים ומופרדים למרכיביהם המרכיבים אותם באמצעות מספר שיטות. טכניקה זו יכולה לשמש חוקרים כדי לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאי יונקים או להעשרה של חלבונים בעלי שפע נמוך שאחרת לא היו ניתנים לגילוי. אמנם קיימות כיום שיטות לפיצול תת-תאי, וכך גם ערכות מסחריות שניתן לרכוש, אך הן סובלות מכמה מגבלות שהליך זה מנסה להתגבר עליהן. רוב שיטות חלוקת התאים מבוססות אך ורק על 1,2 על דטרגנטים, תוך הסתמכותעל שימוש במאגרים המכילים כמויות הולכות וגדלות של חומרי ניקוי כדי לבודד רכיבים תאיים שונים. בעוד ששיטה זו מהירה ונוחה, היא גורמת לשברים לא טהורים. אלה נועדו לאפשר לחוקרים לבודד בקלות מרכיב אחד או שניים של התא, אך אינם מורכבים מספיק כדי לבודד שברים תת-תאיים מרובים מדגימה בו זמנית. הסתמכות על דטרגנטים בלבד גורמת בדרך כלל לכך שאברונים סגורים בממברנה וממברנת הפלזמה מסולפת ללא הבחנה, מה שמקשה על הפרדת רכיבים אלה. סיבוך נוסף מהשימוש בערכות אלה הוא חוסר היכולת של החוקרים לשנות/לייעל אותן עבור יישומים ספציפיים, שכן רוב הרכיבים הם פורמולציות קנייניות. לבסוף, ערכות אלה יכולות להיות יקרות להחריד, עם מגבלות במספר השימושים שהופכות אותן לפחות אידיאליות עבור דגימות גדולות יותר.
למרות הזמינות של ערכות לבידוד מיטוכונדריה שאינן מסתמכות על חומרי ניקוי, הן אינן מיועדות לבודד את קרום הפלזמה ולהניב כמויות דגימה נמוכות משמעותית מפרוטוקולי בידודסטנדרטיים 3,4. בעוד ששיטות צנטריפוגה דיפרנציאליות גוזלות זמן רב יותר, לעתים קרובות הן יוצרות שברים נפרדים שלא ניתן להשיג באמצעות ערכות מבוססות דטרגנטיםבלבד 1. הפרדה ללא שימוש בלעדי בדטרגנטים מסיסים מאפשרת גם טיהור נוסף באמצעות שיפועים אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות איזופיקנית, וכתוצאה מכך פחות זיהום צולב. פרוטוקול פיצול זה מדגים את הבידוד של שברים תת-תאיים ממונוציטים U937 באמצעות שילוב של גישות מבוססות דטרגנטים וצנטריפוגות במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר בידוד של מרכיבי הממברנה הגרעינית, הציטופלסמית, המיטוכונדרית והפלזמה של תא יונק עם זיהום מינימלי בין השברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>61-BB50-DX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>end-over-end rotator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexylene glycol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>68340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7771</td>
			<td>Non-ionic, non-denaturing detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>23565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>7048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep (Iodixanol)&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail, General Use</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M221-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S50-ST Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>436143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate (SOV)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>567540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered Saline (TBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>non-ionic detergent in western blotting buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VDAC (D73D12)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4661</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell fractionation of u937 cells by isopycnic density gradient purification

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשגת שברי חלבון תת-תאיים מתאי יונקים באמצעות שילוב של דטרגנטים, תזה מכנית וצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות איזופיקנית. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא אינו מסתמך על השימוש הבלעדי בדטרגנטים מפריכים כדי להשיג שברים תת-תאיים. זה מאפשר להפריד את קרום הפלזמה מאברונים אחרים הקשורים לממברנה של התא. הליך זה יקל על קביעת לוקליזציה של חלבונים בתאים בשיטה ניתנת לשחזור, מדרגית וסלקטיבית. שיטה זו שימשה בהצלחה לבידוד חלבונים ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות פלזמה מקו תאי המונוציטים האנושיים, U937. למרות שהוא ממוטב עבור קו תאים זה, הליך זה עשוי לשמש כנקודת התחלה מתאימה לפיצול תת-תאי של קווי תאים אחרים. מכשולים פוטנציאליים של ההליך וכיצד להימנע מהם נדונים כמו גם שינויים שאולי צריך לקחת בחשבון עבור קווי תאים אחרים.

תרשים זרימה סכמטי של הליך זה (איור 1) מסכם באופן חזותי את הצעדים שננקטו כדי לפרק בהצלחה U9375 תאים שגודלו בתרחיף. שברים שנאספו מראש שיפוע הצפיפות האיזופיקנית בנפחים שווים (1 מ"ל) מראים את הטיהור של שברי המיטוכונדריה והממברנה (איור 2). שימוש בנוגדן נג?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification at JoVE.com

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי, משום שהוא מספק שיטה להפרדת ארבעה תאים זה מזה, הציטופלסמה, הגרעין, המיטוכונדריה והממברנה. לא רק זה, אלא שמדובר בהליך מדרגי וניתן לשחזור שיש לו תוצאות אמינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפרדת ארבעה תאים עם שימוש מינימלי של חומרי ניקוי, מה שמאפשר הליך פיצול הרבה יותר ניתן לשחזור ואמין.לבידוד חלבונים ציטוזוליים, לגדל תאי U937 ב-RPMI 1640 עם 10% סרום בקר עוברי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד לסך סופי של 6 על 10 לתאים השמיניים. צנטריפוגה של התרבית, והשהה את כדור התא בטמפרטורת החדר PBS לריכוז סופי של ארבעה על 10 עד התאים השישיים למיליליטר, תוך פיפטציה עדינה כדי לשבור גושים. לאחר צנטריפוגה שנייה, יש לתלות את הכדור במאגר תסיסה קר כקרח A בריכוז סופי של שניים על 10 עד לתאים השביעיים למיליליטר.הוסיפו 7.5 מיליליטר של תאים לצינור חרוטי על הקרח לצורך מיצוי חלבונים גרעיניים במורד הזרם, והפילו את התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה. יש להשעות את הכדור במאגר בידוד ציטופלסמי בריכוז סופי של שניים על 10 עד לתאים השביעי למיליליטר, תוך פיפטציה עדינה לפירוק גושים, לפני דגירה של התאים למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב קצה על קצה. בסוף הדגירה, צנטריפוגה את מתלה התא ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה נקי.צנטריפוגה של הסופר-נאטנט כדי להשקיע את הפסולת התאית. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש, וחזרו על רצף הצנטריפוגות עד שלא ניתן יהיה לצפות בכדור. כאשר הדגימה נקייה מפסולת, אחסנו את הסופר-נטנט המכיל שברים ציטוזוליים למשך עד חודש בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן יש להשעות את גלולת התא המאוחסנת במאגר ליזה A לריכוז סופי של ארבעה על 10 עד לתאים השישיים למיליליטר. עבור הומוגניזציה של תאים, צנטריפוגה של תרחיף התא ולהשליך את supernatant כדי להסיר עודף digitonin ומזהמים סיסטוליים. יש להשעות את הכדור בחיץ הומוגניזציה של תאים קרים כקרח בריכוז סופי של 4 על 10 עד לתאים השישיים למיליליטר למשך דגירה של 30 דקות על קרח.בינתיים, עבור תזה מכנית מבוססת חרוזים, הוסף 30 גרם של חרוזי נירוסטה שטופים מראש 3.2 מילימטר ל -15 מיליליטר של חיץ ליזה B בצינור חצאית של 50 מיליליטר על קרח כדי להתקרר. בסוף הדגירה, החלף את החיץ בצינור החצאית עם השעיית התא ומזג את התאים במשך חמש דקות במהירות שמונה. לאחר תזה, להעביר את homogenate לצינור נקי.צנטריפוגה הומוגנית, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש. כדי להסיר את כל הפסולת שנותרה מהמדגם, צנטריפוגה את ההומוגנט שלוש פעמים כפי שצוין, ולהעביר את הסופרנטנט לצינור חדש לאחר כל צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, כדי לבודד את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי, העבירו את הסופר-נטנט לצינור חדש לצנטריפוגה.לאחר צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש והניחו את הכדור הגולמי המכיל שבר מיטוכונדריאלי על קרח. כדי לבודד את שבר הממברנה, צנטריפוגה של הסופרנטנט שנאסף, ולאחר השלכת הסופרנטנט מניחים את הכדור המכיל שבר קרום גולמי על קרח. לטיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית, יש להשעות את כדורי המיטוכונדריה והממברנה הגולמיים ב-200 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס B, ו-1.8 מיליליטר של יודיקסנול.כדי ליצור שיפוע יודיקסנול רציף עבור כל דגימה, ראשית, הוסף מיליליטר אחד של 15% יודיקסנול לתחתיתו של צינור אולטרה-צנטריפוגה אחד בעל שמונה מיליליטר פתוח בעל דופן דקה לכל דגימה. לאחר מכן, שכבה ברצף מיליליטר אחד של 20% יודיקסנול, מיליליטר אחד של 25% יודיקסנול, מיליליטר אחד של 30% יודיקסנול, ומיליליטר אחד של 35% יודיקסנול מתחת לשכבת 15%יודיקסנול בכל צינור. הוסף שני מיליליטר של תרחיף גלולה מיטוכונדריאלי גולמי מתחת לשכבה התחתונה של שיפוע אחד, ושני מיליליטר של תרחיף גלולה קרום גולמי מתחת לשכבה התחתונה של השיפוע השני.שכבה בזהירות מיליליטר אחד של 10% יודיקסנול על החלק העליון של כל שיפוע ולאזן את הצינורות בתוך 10 מיקרוגרם אחד של השני על ידי תוספת של 10% יודיקסנול לפי הצורך לפני טיהור שברים המיטוכונדריאליים והממברנה על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. בסוף ההפרדה, השתמש במחט כדי לנקב את הצד של הצינורות הדקים כדי לאסוף את הרצועות הנראות מכל דגימה. לבידוד חלבונים גרעיניים, צנטריפוגה של 7.5 מיליליטר אליקוט של תאים התלויים בחיץ תזה A, והשהה את הכדור ב-800 מיקרוליטרים של חיץ סילוק תאים קרים כקרח עם פיפטינג ומערבולות.דגירה של התרחיף על הקרח במשך 30 דקות כדי לשבש את קרומי הפלזמה והאברונים, תוך הגנה על החלבונים הגרעיניים. בתום הדגירה, צנטריפוגה של תליית התא והשעיית הכדור על ידי צנרת עדינה ב-800 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס גרעיני קר כקרח בתוספת יחידה אחת למיקרוליטר של בנזונאז. לדגום את התערובת על קצה מעל הקצה מסובב בארבע מעלות צלזיוס כדי לשבש את קרום הגרעין.לאחר 30 דקות, סוניקו את התערובת שלוש פעמים למשך חמש שניות בעוצמה של 20% עם הפסקה של חמש שניות בין פולסים כדי להטות את חומצות הגרעין. לאחר הסוניקציה האחרונה, צנטריפוגה את ההומוגנט ולאסוף את supernatant כמו חלק גרעיני מבלי להפריע את הכדור. כתם מערבי של כל אחד מהשברים לאחר טיהור גרדיאנט צפיפות מראה לוקליזציה של החלק המיטוכונדריאלי לשכבות 25 ו-30% יודיקסנול, ולוקליזציה של שבר הממברנה לשכבות 10% ו-15% יודיקסנול.ניתוח דם מערבי גם מאשר כי כל דגימה מבודדת היא טהורה ונקייה מזיהום על ידי חלבונים מחלקים אחרים של התא. בנוסף, ניתוח דנסיטומטרי של עוצמת הפסים של כל דגימה מאשר את השכפול והמובהקות הסטטיסטית של הנתונים. ביצוע לא תקין של הפיצול עלול לגרום לזיהום צולב של הרכיבים התאיים.ריכוז גבוה של היסטון H3 בחלק הציטוזולי, למשל, יכול לנבוע מהבהרה לא נכונה של השבר הציטוזולי. כישלון במהלך טיהור הצפיפות האיזופיקנית עלול לגרום לזיהום של חלק הממברנה. זה יכול להיות שימושי לבצע בדיקת כימות חלבון לפני ניתוח הדם המערבי כדי לאשר כי השברים אכן מכילים חלבון כדי לאפשר העמסת ג'ל על בסיס כמות החלבון, ולאשר כי ההליך בוצע כראוי.זה קריטי כי השבר הציטופלסמי לא יכיל גלולה. כתמים מערביים, או ELISAs עשויים להתבצע לאחר הליך זה כדי לאפשר לך לנתח את המיקום התת-תאי של חלבונים שונים בתנאים מסוימים. טכניקה זו אפשרה לנו לנתח את הסחר בגורמי מוות תאיים שונים בתנאים של היפרגליקמיה.וכך, עבורנו, זה עזר לשפוך אור על המנגנון של המעבר ההיפרגליקמי מאפופטוזיס לנמק.