Brug af GAL4-UAS System for Funktionel Genetik i Anopheles gambiae

Det tværpolitiske GAL4-UAS-system er et alsidigt og kraftfuldt værktøj til funktionel genetisk analyse. Essensen af systemet er at krydse transgene 'driver' linjer, der udtrykker gær transskription faktor GAL4 på en vævsspecifik måde, med transgene 'responder' linjer bærer en kandidat gen / RNA interferens konstruktion, hvis udtryk er kontrolleret af Upstream Aktivering Sekvenser (UAS), der binder GAL4. I det efterfølgende afkom udtrykkes gen- eller lyddæmpningskonstruktionen således på en foreskrevet spatiotemporal måde, hvilket gør det muligt at analysere de resulterende fænotyper og udlede genfunktion. Det binære system muliggør fleksibilitet i eksperimentelle tilgange til at screene fænotyper genereret af transgene udtryk i flere vævsspecifikke mønstre, selv om alvorlige fitness omkostninger er induceret. Vi har tilpasset dette system til Anopheles gambiae, den vigtigste malaria vektor i Afrika.

I denne artikel leverer vi nogle af de fælles procedurer, der anvendes under GAL4-UAS-analyse. Vi beskriver an. gambiae GAL4-UAS linjer, der allerede er genereret, samt kloning af nye responder konstruktioner til upregulation og RNAi knockdown. Vi specificerer en trinvis vejledning til sexing af myg pupper til at etablere genetiske kors, der også omfatter screening afkom til at følge arv af fluorescerende genmarkører, der mærker føreren og responder indsættelser. Vi præsenterer også en protokol for rydning af an gambiae embryoner for at studere embryonal udvikling. Endelig introducerer vi potentielle tilpasninger af metoden til at generere driverlinjer gennem CRISPR/Cas9-indsættelse af GAL4 nedstrøms af målgener.