Abstract
Genetics
מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית היא כלי רב-תכליתי ורב עוצמה לניתוח גנטי פונקציונלי. המהות של המערכת היא לחצות קווי 'נהג' מהונדסים המבטאים את גורם שעתוק השמרים GAL4 באופן ספציפי לרקמה, עם קווי 'מגיב' מהונדסים הנושאים מבנה הפרעות גן/RNA מועמד שהביטוי שלו נשלט על ידי רצפי הפעלה במעלה הזרם (UAS) הקושרים את GAL4. בצאצאים שלאחר מכן, הגן או מבנה ההשתקה מתבטא אפוא באופן spatiotemporal שנקבע, המאפשר פנוטיפים הנובעים להיות נבזי ותפקוד הגנים להסיק. המערכת הבינארית מאפשרת גמישות בגישות ניסיוניות למסך פנוטיפים הנוצרים על ידי ביטוי טרנסג'ן בדפוסים ספציפיים לרקמות מרובות, גם אם עלויות כושר חמורות מושרות. התאמנו את המערכת הזו לאנופלס גמביה, וקטור המלריה העיקרי באפריקה.
במאמר זה, אנו מספקים חלק מההליכים הנפוצים המשמשים במהלך ניתוח GAL4-UAS. אנו מתארים את קווי AN. gambiae GAL4-UAS שכבר נוצרו, כמו גם את השיבוט של מבני מגיב חדשים עבור upregulation ו RNAi נוקאאוט. אנו מציינים מדריך צעד אחר צעד למין של גולם יתושים כדי ליצור צלבים גנטיים, הכולל גם צאצאי סינון כדי לעקוב אחר ירושה של סמני גנים פלואורסצנטיים המתייגים את הנהג ואת החדרות המגיב. אנו מציגים גם פרוטוקול לפינוי עוברים של גמביה כדי לחקור התפתחות עוברית. לבסוף, אנו מציגים התאמות פוטנציאליות של השיטה ליצירת קווי נהג באמצעות CRISPR/Cas9 החדרה של GAL4 במורד הזרם של גנים היעד.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved