Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae

Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile e potente per l'analisi genetica funzionale. L'essenza del sistema è quella di incrociare linee transgeniche "driver" che esprimono il fattore di trascrizione del lievito GAL4 in modo specifico per il tessuto, con linee transgeniche "responder" portatrici di un costrutto di interferenza gene/RNA candidato la cui espressione è controllata da Upstream Activation Sequences (UAS) che legano GAL4. Nella progenie che ne consegue, il gene o il costrutto di silenziamento è quindi espresso in modo spaziotemporale prescritto, consentendo di dosare i fenotipi risultanti e di dedurre la funzione genica. Il sistema binario consente flessibilità negli approcci sperimentali per lo screening dei fenotipi generati dall'espressione transgenica in più modelli tessuto-specifici, anche se sono indotti gravi costi di fitness. Abbiamo adattato questo sistema per Anopheles gambiae, il principale vettore di malaria in Africa.

In questo articolo vengono fornite alcune delle procedure comuni utilizzate durante l'analisi GAL4-UAS. Descriviamo le linee An. gambiae GAL4-UAS già generate, così come la clonazione di nuovi costrutti di responder per l'upregulation e il knockdown RNAi. Specifichiamo una guida passo passo per il sexing delle pupe di zanzara per stabilire incroci genetici, che include anche lo screening della progenie per seguire l'ereditarietà di marcatori genetici fluorescenti che etichettano le inserzioni del conducente e del soccorritore. Presentiamo anche un protocollo per la rimozione degli embrioni di An. gambiae per studiare lo sviluppo embrionale. Infine, introduciamo potenziali adattamenti del metodo per generare linee driver attraverso l'inserimento CRISPR/Cas9 di GAL4 a valle dei geni bersaglio.