Использование системы GAL4-UAS для функциональной генетики в Anopheles gambiae

Двусторонняя система GAL4-UAS является универсальным и мощным инструментом для функционального генетического анализа. Суть системы заключается в пересечении трансгенных «драйверных» линий, которые экспрессируют фактор транскрипции дрожжей GAL4 тканевым специфическим образом, с трансгенными линиями «ответчика», несущими интерференционную конструкцию гена / РНК, экспрессия которой контролируется восходящими последовательностями активации (UAS), которые связывают GAL4. Таким образом, в последующем потомстве ген или глушительная конструкция экспрессируется предписанным пространственно-временным способом, что позволяет анализировать результирующие фенотипы и выводить функцию гена. Бинарная система обеспечивает гибкость в экспериментальных подходах к скринингу фенотипов, генерируемых экспрессией трансгенов в нескольких тканеспецифических паттернах, даже если вызваны серьезные затраты на приспособленность. Мы адаптировали эту систему для Anopheles gambiae, основного переносчика малярии в Африке.

В этой статье мы приводим некоторые из распространенных процедур, используемых при анализе GAL4-UAS. Мы описываем уже сгенерированные линии An. gambiae GAL4-UAS, а также клонирование новых конструкций ответчиков для повышения регуляции и нокдауна RNAi. Мы указываем пошаговое руководство по половому использованию кукол комаров для установления генетических скрещиваний, которое также включает скрининг потомства для отслеживания наследования флуоресцентных генных маркеров, которые помечают вставки водителя и ответчика. Мы также представляем протокол очистки эмбрионов An. gambiae для изучения эмбрионального развития. Наконец, мы вводим потенциальные адаптации метода для генерации линий драйверов посредством вставки CRISPR/Cas9 GAL4 после генов-мишеней.