Platsstyrd φC31-medierad integration och kassettutbyte i Anopheles vektorer av malaria

Funktionell genomisk analys och relaterade strategier för genetisk kontroll av malaria förlitar sig på validerade och reproducerbara metoder för att exakt modifiera genomet av Anopheles myggor. Bland dessa metoder möjliggör φC31-systemet exakt och stabil platsstyrd integrering av transgener, eller ersättning av integrerade transgena kassetter via rekombinerasmedierat kassettutbyte (RMCE). Denna metod bygger på verkan av Streptomyces φC31 bakteriofagintegras för att katalysera rekombination mellan två specifika fästpunkter som betecknas attP (härlett från fag) och attB (härledd från värdbakterien). Systemet använder en eller två attP-platser som tidigare har integrerats i mygggenomet och attB-platserna i donatormallens DNA. Här illustrerar vi hur man stabilt modifierar genomet av attP-bärande Anopheles dockningslinjer med hjälp av två plasmider: en attB-märkt donator som bär integrations- eller utbytesmallen och en hjälpare plasmid som kodar φC31 integrase. Vi rapporterar två representativa resultat av φC31-medierade plats-riktade modifiering: den enda integrationen av en transgenic kassett i An. stephensi och RMCE i An. gambiae myggor. φC31-medierad genommanipulation erbjuder fördelen med reproducerbara transgene uttryck från validerade, fitness neutrala genomiska platser, vilket möjliggör jämförande kvalitativa och kvantitativa analyser av fenotyper. Integrationens platsstyrda karaktär förenklar också avsevärt valideringen av det enskilda insättningsstället och parningssystemet för att erhålla en stabil transgen linje. Dessa och andra egenskaper gör φC31-systemet till en viktig komponent i den genetiska verktygslådan för transgen manipulation av malariamyggor och andra insektsvektorer.