Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies DE026172 (I.S.) en GM102801 (A.C.). I.S. werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) -beurs (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) en Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) -beurs (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met een protocol dat is goedgekeurd door de KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met hun richtlijnen en voorschriften (Protocolnummer: 2018-2447).
1. Oogst E13.5 embryo's
<ol><li>Euthanaseer zwangere vrouwelijke muizen met behulp van een CO 2-inhalatiekamer of volgens een procedure die is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Ga onmiddellijk over tot dissectie.</li>
	<li>Stel de inferieure ...

Palatale plankverhoging vormt een verticale tot horizontale verbouwingsgebeurtenis1,3,4,9,11. Er wordt gepostuleerd dat dit remodelleringsproces vereist dat palatale plank mesenchymale cellen zich gecoördineerd gedragen. De analyses met wildtype MEPM-cellen tonen aan dat dit celgedrag intrinsiek is en gekwantificeerd kan worden21. Deze...

De ontwikkeling van het gehemelte is uitgebreid bestudeerd omdat defecten in palatogenese leiden tot gespleten gehemelte - een veel voorkomende aangeboren afwijking die optreedt in geïsoleerde gevallen of als onderdeel van honderden syndromen1,2. De ontwikkeling van het embryonale gehemelte is een dynamisch proces dat beweging en fusie van embryonaal weefsel omvat. Dit proces kan worden onderverdeeld in vier belangrijke stappen: 1) inductie van palatale planken, 2) verticale groei van de palatale planken naast de tong, 3) verhoging van de palatale planken boven de tong en 4) fusie van de palatale planken op de middellijn1,3,4. In de afgelopen decennia zijn veel muismutanten geïdentificeerd die een gespleten gehemelte manifesteren5,6,7,8. Karakterisering van deze modellen heeft defecten in palatale plankinductie, proliferatie en fusiestappen aangegeven; palatale plankverhogingsdefecten zijn echter zeldzaam. Het begrijpen van de dynamiek van palatale plankverhoging is dus een intrigerend onderzoeksgebied.
Zorgvuldige analyse van sommige muismutanten met palatale plankverhogingsdefecten heeft geleid tot het huidige model waaruit blijkt dat het voorste gebied van de palatale plank omhoog lijkt te klappen, terwijl een verticale naar horizontale beweging of "remodellering" van de palatale planken plaatsvindt in het midden tot achterste gebieden van het gehemelte1,3,4, 9,10,11. Het mediale randepitheel van de palatale plank initieert waarschijnlijk de signalering die nodig is voor deze remodellering, die vervolgens wordt aangedreven door het mesenchym van de palatale plank. Onlangs hebben veel onderzoekers palatale plankverhogingsvertraging geïdentificeerd in muismodellen die voorbijgaande orale verklevingen vertoonden met betrekking tot palataleplanken 12,13. De mesenchymale remodellering omvat reorganisatie van de cellen om een uitstulping in horizontale richting te creëren, terwijl tegelijkertijd de palatale plank in de verticale richting9,10,14wordt ingetrokken. Onder de verschillende mechanismen die worden voorgesteld om de palatale schapverhoging en de onderliggende mesenchymale remodellering tebeïnvloeden,zijn celproliferatie15,16, 17,chemotactische gradiënten18en extracellulaire matrixcomponenten19,20. Een belangrijke vraag rees: is de palatale plankverhogingsvertraging die wordt waargenomen bij Specc1l-deficiënte muizen ook gedeeltelijk te wijten aan een defect in de palatale plankremodellering, en zou dit remodelleringsdefect zich kunnen manifesteren in een intrinsiek defect in het gedrag van primaire MEPM-cellen21?
Primaire MEPM-cellen zijn gebruikt in het craniofaciale veld voor vele studies met genexpressie22,23,24,25,26,27,28,29,en een paar met proliferatie30,31 en migratie25,31,32 , maar geen voor collectieve celgedragsanalyse. Time-lapse beeldvorming van MEPM-cellen werd uitgevoerd in 2D-cultuur en wondhersteltests om aan te tonen dat MEPM-cellen directionele beweging vertoonden en dichtheidsafhankelijke celstromen-attributen van collectieve beweging vormden21. Bovendien vormden Specc1l-mutante cellen smallere celstromen en vertoonden ze zeer variabele celmigratietrajecten. Dit gebrek aan gecoördineerde beweeglijkheid wordt geacht bij te dragen aan de vertraging van de verhoging van het gehemelte in Specc1l mutante embryo's13,21. Deze relatief eenvoudige testen met behulp van primaire MEPM-cellen kunnen dus dienen als een proxy voor het bestuderen van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging. Dit artikel beschrijft de isolatie en cultuur van primaire MEPM-cellen, evenals de time-lapse beeldvorming en analyse, voor de 2D- en wondhersteltests.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker, 250 mL (x2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-100-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Matheson Gas</td>
			<td>UN1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 15 mL (x1)</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debian operating system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>computational analysis of time-lapse images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, 100%</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEPVH028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument sterilizer bead bath</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge tubes, 1.5mL</td>
			<td>Avant</td>
			<td>2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Insert, 2-well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Perforated Stainless Steel Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>MC17C</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors, 4 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm dishe(s)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plate(s)</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>667512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6-well plate(s)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic bulb transfer pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes

Ontwikkeling van het gehemelte is een dynamisch proces, waarbij verticale groei van bilaterale palatale planken naast de tong wordt gevolgd door verhoging en fusie boven de tong. Defecten in dit proces leiden tot gespleten gehemelte, een veel voorkomende aangeboren afwijking. Recente studies hebben aangetoond dat palatale plankverhoging een verbouwingsproces omvat dat de oriëntatie van de plank transformeert van een verticale naar een horizontale. De rol van de palatale plank mesenchymale cellen in deze dynamische remodellering is moeilijk te bestuderen. Time-lapse-imaging-gebaseerde kwantitatieve analyse is onlangs gebruikt om aan te tonen dat primaire muis embryonale palatale mesenchymale (MEPM) cellen zichzelf kunnen organiseren in een collectieve beweging. Kwantitatieve analyses konden verschillen in gemuteerde MEPM-cellen identificeren van een muismodel met gehemelte-elevatiedefecten. Dit artikel beschrijft methoden om MEPM-cellen van E13.5-embryo's te isoleren en te kweken - specifiek voor time-lapse beeldvorming - en om verschillende cellulaire kenmerken van collectieve beweging te bepalen, waaronder metingen voor stroomvorming, vormuitlijning en persistentie van richting. Het stelt dat MEPM-cellen kunnen dienen als een proxymodel voor het bestuderen van de rol van palataal plankmesenchym tijdens het dynamische proces van elevatie. Deze kwantitatieve methoden zullen onderzoekers in het craniofaciale veld in staat stellen om collectieve bewegingsattributen in controle- en mutante cellen te beoordelen en te vergelijken, wat het begrip van mesenchymale remodellering tijdens palatale plankverhoging zal vergroten. Bovendien bieden MEPM-cellen een zeldzaam mesenchymaal celmodel voor onderzoek naar collectieve celbewegingen in het algemeen.

De dissectie van palatale planken wordt geïllustreerd in figuur 1. De volgorde van incisies is ontworpen om uitglijden van het weefsel te minimaliseren. Na het verwijderen van de kop(figuur 1A,B)wordt de onderkaak verwijderd(figuur 1B,C). De incisie van het bovenste deel van de kop (Figuur 1C, D) wordt gedaan om het weefsel te stabiliseren wanneer het ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes at JoVE.com

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Dit protocol stelt onderzoekers in het craniofaciale veld in staat om collectief bewegingsattributen in controle- en mutante cellen kwantitatief te vergelijken als een middel om mesenchymale remodellering te begrijpen tijdens palatale plankverhoging. Het gebruik van primaire muisembryonale palatale mesenchymale cellen en time-lapse beeldvorming bieden een toegankelijke proxymethode voor het beoordelen van palatale schapverhogingsdynamiek. Om palatale schelpen van een muizenembryo te oogsten, gebruikt u een gesteriliseerde geperforeerde lepel om een embryonale dag 13,5 embryo in een steriele schaal van 10 centimeter gevuld met steriel MEPM-kweekmedium onder een stereomicroscoop te plaatsen.Steek na onthoofding een punt van een gesteriliseerde fijne No.5-tang in de mond net binnen de wang en duw de punt van de tang totdat deze de achterkant van de schedel verlaat. Oriënteer de tang zo dat de andere arm net over de gehoorgang zweeft voordat je de tang dichtknijpt om het weefsel door te snijden. Herhaal de incisie aan de andere kant van het hoofd en zet de knijpprocedure voort totdat de onderkaak, tong en het inferieure deel van de schedel zijn verwijderd, waardoor de palatale planken worden blootgesteld.Met het hoofd op zijn kant geplaatst, plaats je de uiteinden van een kleine, steriele, roestvrijstalen schaar voor en achter de schedel, ongeveer op ooghoogte van het embryo en snijd je net boven de ogen om de schedel van de schedel te verwijderen, waardoor een plat oppervlak ontstaat. Plaats vervolgens het hoofd ondersteboven met het superieure aspect plat op de bodem van de schaal en zoek de palatale planken, die zichtbaar moeten zijn als twee verhoogde bruggen aan weerszijden van de centrale groef in de voorste helft van het hoofd. Om het hoofd aan de schaal te beveiligen, steekt u een punt van een fijne tang door het weefsel in de buurt van het neusgebied van het hoofd vooraan naar de palatale planken en de andere door de basis van de schedel achteraan naar de palatale planken.Steek beide punten van een tweede paar zeer scherpe, fijne tangen in het weefsel aan de basis van het laterale oppervlak van de plank en knijp langzaam en voorzichtig om het weefsel te snijden. Herhaal de incisie langs de basis van het mediale oppervlak van de plank en aan zowel de voorste als de achterste uiteinden van de plank om de plank los te maken van de bevestiging aan het hoofd, til vervolgens voorzichtig de plank op en maak extra knijpen indien nodig om de schaal volledig te bevrijden van het omliggende weefsel. Wanneer de tweede palatale plank op dezelfde manier is verwijderd, gebruikt u een steriele plastic boltransferpipet om de planken over te brengen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter in ongeveer 500 microliter PBS op ijs.Om een MEPM-celkweek op te zetten, wanneer alle planken zijn verzameld, aspirateer je de PBS zonder de weefsels te verstoren en voeg je onmiddellijk 200 microliter van 37 graden Celsius 0,25% trypsine toe aan elke buis van palataal plankweefsel. Gebruik een pipet van 1.000 microliter om de weefsels een paar keer kort te pipetteren en incubeer de weefsels gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius, waarbij u na vijf minuten kort pipettert. Pipetteer de weefsels aan het einde van de incubatie opnieuw voordat u 800 microliter MEPM-kweekmedium aan elke buis toevoegt en de buizen centrifugeert om de cellen te verzamelen.Na het opzuigen van het supernatant, resuspendeert u de pellets in één milliliter vers MEPM-kweekmedium per buis en vergulden u de cellen in individuele putten van een met zes putweefselkweek behandelde plaat met twee milliliter per put tot een eindtotaal van drie milliliter per put, en laat de cellen zich vervolgens gedurende 12 uur hechten aan het plastic oppervlak in een steriele celkweekincubator. Om een collectieve 2D-migratietest op te zetten, verwijdert u de bovenkant van een steriele siliconeninzetstuk met twee putten tot een hoogte van ongeveer een millimeter voor elk te analyseren monster en gebruikt u steriele tangen om de verkorte, steriele twee-putinzetstukken in het midden van individuele putten van een zes-putplaat te plaatsen. Druk langs alle randen naar beneden om ervoor te zorgen dat de inzetstukken volledig op de putbodems zijn geplakt en zaai 300 MEPM-cellen per vierkante millimeter van de verkorte siliconeninzetstukken in een totaal volume van 40 tot 50 microliter MEPM-kweekmedium in elke insert voor een nachtelijke incubatie in de celkweekincubator.Om een wondreparatietest op te zetten, gebruikt u een steriele tang om één ongewijzigde steriele siliconeninzet met twee putten in het midden van één put van een plaat met zes putten per monster te plaatsen en drukt u stevig op de randen van het inzetstuk om het inzetstuk aan de kweekplaat te bevestigen. Zaai vervolgens 1.400 cellen per vierkante millimeter in 100 microliter MEPM-kweekmedium in elke insert en incubeer de cellen gedurende 48 uur in het celkweekmedium. Bij het uitvoeren van een collectieve 2D-migratietest biedt het zaaien van de cellen in siliconeninzetstukken met twee putten in een grote kweekschaal meestal een betere celdichtheid voor beeldvorming.Kleine 3D-geprinte ringen geplaatst in een 35 millimeter schotel kunnen ook worden gebruikt voor 2D-motiliteitsanalyse. Voor wondhersteltests worden de cellen gekweekt in siliconeninzetstukken met twee putten tot een hoge samenvloeiing. De inserts worden vervolgens verwijderd en de wond wordt in beeld brengen tot sluiting.MEPM-trajecten zijn persistent en de richting van de celmotiliteit wordt gedurende enkele uren gehandhaafd. De gemiddelde verplaatsing versus tijd analyse geeft aan dat de persistentie in de vorm van verplaatsing evenredig is met de verstreken tijd. Stroomanalyse van de motiliteitsgegevens laat zien dat de co-bewegende MEPM-celclusters ongeveer 300 micron groot zijn.Er wordt ook een diepgaand motiliteitsverschil waargenomen tussen wildtype en gemuteerde MEPM-cellen. Deze procedure kan worden gebruikt op verschillende transgene muislijnen en om MEPM-cellen te behandelen met verschillende biochemische reagentia om hun effecten op celbewegingen te bestuderen. We hebben ons gericht op primaire palatale mesenchymcellen, maar de time-lapse beeldvorming en kwantitatieve analyses kunnen ook worden gebruikt om de migratiekenmerken van elk beweeglijk celtype in dynamische ontwikkelingsprocessen te onderzoeken.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Abstract