Bu proje kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri TARAFıNDAN DE026172 (I.S.) ve GM102801 (A.C.) hibeleri tarafından desteklendi. I.S. ayrıca kısmen Biyomedikal Araştırma Mükemmelliği Merkezi (COBRE) hibesi (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20 GM104936), Kansas IDeA Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Ağı hibesi (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20 GM103418) ve Kansas Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (KIDDRC) hibesi (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development) tarafından desteklendi. HD090216).

Hayvanları içeren tüm deneyler, kumc Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol ile, kılavuz ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Protokol Numarası: 2018-2447).
1. Hasat E13.5 embriyoları
<ol><li>Hamile dişi fareleri CO2 inhalasyon odası kullanarak veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir prosedürle ötenazi yaptırın. Hemen diseksiyona devam edin.</li>
	<li>Cildi ve peritonlar?...

Palatal raf yüksekliği dikeyden yataya yeniden şekillendirme olayı1, 3,4,9,11oluşturur. Bu tadilat işleminin palatal raf mezenkimal hücrelerin koordineli davranmasını gerektirdiği açıktır. Wildtype MEPM hücreleri ile yapılan analizler, bu hücre davranışının içsel olduğunu ve21. Bu nedenle, bu tahliller, yarık dama...

Damak gelişimi, palatogenezdeki kusurlar, izole vakalarda veya yüzlerce sendromun bir parçası olarak ortaya çıkan yarık damak-yaygın bir doğum kusuru olduğu için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir1,2. Embriyonik damak gelişimi embriyonik dokunun hareketini ve füzyonunu içeren dinamik bir süreçtir. Bu işlem dört ana adıma ayrılabilir: 1) palatal rafların indüksiyonu, 2) dilin yanındaki palat raflarının dikey büyümesi, 3) dil üzerindeki palat raflarının yükselmesi ve 4) orta çizgideki palatal rafların füzyonu1,3,4. Son birkaç on yılda, yarık damak 5 ,6,7,8. Bu modellerin karakterizasyonu palatal raf indüksiyonu, çoğalma ve füzyon adımlarında kusurlar olduğunu belirtmiştir; ancak, palatal raf yükselmesi kusurları nadirdir. Bu nedenle, damak raf yüksekliğinin dinamiklerini anlamak ilgi çekici bir araştırma alanıdır.
Palatal raf yükselmesi kusurları olan bazı fare mutantlarının dikkatli analizi, mevcut modelin palatal rafın çok ön bölgesinin yukarı doğru çevrildiğini gösterirken, damak1,3,4'ünorta kısmında yatay hareket veya palat raflarının "yeniden şekillendirilme" meydana geldiğinigösterdi. 9,10,11. Palatal rafın medial kenar epitelleri, daha sonra palatal raf mezenkim tarafından sürülen bu tadilat için gerekli sinyalizasyonu başlatır. Son zamanlarda, birçok araştırmacı palatal rafları içeren geçici oral yapışıklıklar gösteren fare modellerinde palatal raf yükselmesi gecikmesi tespit etti12,13. Mezenkimal remodeling, hücrelerin yatay yönde bir şişkinlik oluşturmak için yeniden düzenlenmesini içerirken, aynı zamanda palatal rafı dikey yönde geri çekme9,10,14. Palatal raf yüksekliğini ve altta yatan mezenkimal remodeling'i etkilemek için önerilen çeşitli mekanizmalar arasında hücre çoğalması15,16,17, kemotaktik gradyanlar18ve hücre dışı matris bileşenleri19,20vardır. Önemli bir soru ortaya çıktı: Specc1leksikliği olan farelerde gözlenen palatal raf yükselme gecikmesi de kısmen palatal raf tadilatındaki bir kusurdan kaynaklanıyor mu ve bu tadilat kusuru birincil MEPM hücrelerinin davranışında içsel bir kusurda ortaya çıkabilirmi 21?
Birincil MEPM hücreleri kraniyofasiyal alanda gen ekspresyasyonu22 , 23,24,25,26,27,28,29ve çoğalma 30,31ve göç 25,31 ,32 içeren birçok çalışma için kullanılmıştır. , ancak kolektif hücre davranışı analizi için yok. MEPM hücrelerinin zaman atlamalı görüntülemesi, MEPM hücrelerinin yönlü hareket gösterdiğini ve toplu hareketin yoğunluğa bağlı hücre akışlarını oluşturduğunu göstermek için 2B kültür ve yara onarım tahlillerindegerçekleştirildi 21. Ayrıca, Specc1l mutant hücreleri daha dar hücre akışları oluşturdu ve oldukça değişken hücre göç yörüngeleri gösterdi. Bu koordineli hareketlilik eksikliği Specc1l mutant embriyolarında damak yükselmesi gecikmesine katkıda bulunmak için kabul edilir13,21. Bu nedenle, birincil MEPM hücrelerini kullanan bu nispeten basit tahliller, palatal raf yüksekliği sırasında mezenkimal remodeling'i incelemek için bir proxy görevi görebilebilir. Bu makalede, birincil MEPM hücrelerinin izolasyonu ve kültürünün yanı sıra 2B ve yara onarım tahlilleri için zaman atlamalı görüntüleme ve analiz açıklanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beaker, 250 mL (x2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-100-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Matheson Gas</td>
			<td>UN1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 15 mL (x1)</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debian operating system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>computational analysis of time-lapse images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Cytiva Life Sciences</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH, 100%</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Auto</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEPVH028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument sterilizer bead bath</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifuge tubes, 1.5mL</td>
			<td>Avant</td>
			<td>2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Insert, 2-well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Perforated Stainless Steel Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>MC17C</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors, 4 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm dishe(s)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plate(s)</td>
			<td>PR1MA</td>
			<td>667512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6-well plate(s)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic bulb transfer pipette</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>202-1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes

Damak gelişiminin gelişimi, dilin yanındaki bilateral damak raflarının dikey büyümesini ve ardından dilin üzerinde yükselme ve füzyonu içeren dinamik bir süreçtir. Bu süreçteki kusurlar, yaygın bir doğum kusuru olan yarık damağa yol açar. Son çalışmalar, palatal raf yüksekliğinin, rafın yönünü dikeyden yataya dönüştüren bir yeniden şekillendirme işlemi içerdiğini göstermiştir. Bu dinamik tadilatta palatal raf mezenkimal hücrelerin rolü üzerinde çalışmak zor olmuştur. Zaman atlamalı görüntüleme tabanlı nicel analiz son zamanlarda primer fare embriyonik palatal mezenkimal (MEPM) hücrelerinin kendi kendine kolektif bir harekete dönüşebileceğini göstermek için kullanılmaktadır. Nicel analizler, mutant MEPM hücrelerindeki farklılıkları damak yükselme kusurları olan bir fare modelinden belirleyebilir. Bu makalede, MEPM hücrelerini E13.5 embriyolarından izole etme ve kültürleme yöntemleri açıklanmaktadır- özellikle zaman atlamalı görüntüleme için- ve akış oluşumu, şekil hizalaması ve yönün kalıcılığı için önlemler de dahil olmak üzere kolektif hareketin çeşitli hücresel özelliklerini belirlemek. MEPM hücrelerinin dinamik yükselme sürecinde palatal raf mezenkiminin rolünü incelemek için bir proxy modeli olarak hizmet edebileceği öne sunun. Bu nicel yöntemler, kraniofasiyal alandaki araştırmacıların kontrol ve mutant hücrelerdeki kolektif hareket niteliklerini değerlendirmelerine ve karşılaştırmalarına izin verecek ve bu da palatal raf yükselmesi sırasında mezenkimal yeniden şekillendirmenin anlaşılmasını artıracaktır. Ayrıca, MEPM hücreleri genel olarak kolektif hücre hareketinin araştırılması için nadir bir mezenkimal hücre modeli sağlar.

Palatal rafların diseksiyonu Şekil 1'degösterilmiştir. Kesi dizisi, dokunun kaymasını en aza indirmek için tasarlanmıştır. Başın çıkarılmasından sonra (Şekil 1A,B), alt çene çıkarılır (Şekil 1B,C). Başın üst kısmının kesisi (Şekil 1C,D) baş aşağı yerleştirildiğinde dokuyu stabilize etmek için</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes at JoVE.com

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.

Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Bu protokol, kraniofasiyal alandaki araştırmacıların, palatal raf yükselmesi sırasında mezenkimal yeniden şekillendirmeyi anlamanın bir yolu olarak kontrol ve mutant hücrelerdeki kolektif hareket niteliklerini nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar. Primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin kullanımı ve hızlandırılmış görüntüleme, palatal raf yükselme dinamiklerini değerlendirmek için erişilebilir bir proxy yöntemi sağlar. Bir fare embriyosundan palatal kabukları toplamak için, sterilize edilmiş bir delikli kaşık kullanarak embriyonik bir gün olan 13,5 embriyonun stereo mikroskop altında steril MEPM kültür ortamı ile dolu steril 10 santimetrelik bir yemeğe yerleştirilmesini sağlar.Kafa kesme işleminden sonra, sterilize edilmiş bir ince No.5 yaban ucunun bir ucunu yanağın hemen içindeki ağza yerleştirin ve kafatasının arkasından çıkana kadar asaların ucunu itin. Tostu, diğer kolun dokuyu kesmek için uzunlamaları sıkıştırmadan önce kulak kanalının hemen üzerinde gezinmesi için yönlendirin. Başın diğer tarafındaki kesiği tekrarlayın, kafatasının alt çenesi, dili ve alt kısmı çıkarılana kadar kıstırma kesme işlemine devam ederek palatal rafları açığa çıkarın.Kafa yanına yerleştirilmişken, kafatasının hemen önünde ve arkasında bir çift küçük, steril, paslanmaz çelik makasın uçlarını embriyonun hemen göz hizasına yerleştirin ve kafatasının kafatasını çıkarmak için gözlerin hemen üstünden kesin, düz bir yüzey oluşturun. Daha sonra, başı, tabağın altına düz duran üstün yönüyle baş aşağı yerleştirin ve başın ön yarısındaki merkezi oluğun her iki tarafında iki yükseltilmiş köprü olarak görülebilecek palat raflarını bulun. Başı yemeğe sabitlemek için, ince bir ön kısmın burun bölgesine yakın dokudan bir ucunu palatal raflara, diğer ucunu da kafatası arka tabanının tabanından damak raflarına yerleştirin.İkinci bir çift çok keskin, ince toskumun her iki noktasını da rafın yan yüzeyinin tabanındaki dokuya yerleştirin ve dokuyu kesmek için yavaşça ve dikkatlice sıkıştırın. Rafın medial yüzeyinin tabanı boyunca ve rafın hem ön hem de arka uçlarında kesiyi tekrarlayın, rafı ataşmanından başa ayırmak için rafı hafifçe kaldırın, kabuğu çevre dokudan tamamen serbest etmek için gerektiğinde ek kıstırmalar yaptı. İkinci palatal raf aynı şekilde çıkarıldığında, rafları buz üzerinde yaklaşık 500 mikrolitre PBS'de steril 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için steril bir plastik ampul transfer pipeti kullanın.Bir MEPM hücre kültürü kurmak için, tüm raflar toplandığında, dokuları bozmadan PBS'yi aspire edin ve hemen her bir palatal raf dokusu tüpüne 37 santigrat derece 200 mikrolitre% 0.25 tripsin ekleyin. Dokuları birkaç kez pipetlamak ve beş dakika sonra kısa bir süre pipetleme yaparak dokuları 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırmak için 1.000 mikroliter pipet kullanın. Kuluçkanın sonunda, her tüpe 800 mikrolitre MEPM kültür ortamı eklemeden ve hücreleri toplamak için tüpleri santrifüjlemeden önce dokuları tekrar pipetle.Süpernatantı aspire ettikten sonra, peletleri tüp başına bir mililitre taze MEPM kültür ortamına yeniden koyun ve hücreleri kuyu başına iki mililitre içeren altı kuyulu doku kültürü ile işlenmiş bir plakanın bireysel kuyularına, kuyu başına son toplam üç mililitreye kadar plakalayın, ardından hücrelerin steril bir hücre kültürü inkübatöründe 12 saat boyunca plastik yüzeye yapışmasına izin verin. 2D toplu göç tahlilini kurmak için, analiz edilecek her numune için bir steril iki kuyulu silikon kesici ucun üst kısmını yaklaşık bir milimetre yüksekliğe çıkarın ve kısaltılmış, steril iki kuyulu uçları altı kuyulu bir plakanın tek tek kuyularının ortasına kaplamak için steril forseps kullanın. Hücre kültürü inkübatöründe bir gecede inkübasyon için her kesici uçta toplam 40 ila 50 mikrolitre MEPM kültür ortamı hacminde kısaltılmış silikon kesici uçların milimetre kare başına kuyu diplerine ve tohum 300 MEPM hücresine tam olarak yapıştığından emin olmak için tüm kenarlar boyunca bastırın.Bir yara onarım tahlilini ayarlamak için, bir değiştirilmemiş steril iki kuyulu silikon kesici ucu numune başına altı kuyulu bir plakanın ortasına yerleştirmek için steril tokmaklar kullanın ve kesici ucu kültür plakasına takmak için kesici ucun kenarlarına sıkıca bastırın. Daha sonra her kesici uçta 100 mikrolitre MEPM kültür ortamında milimetre kare başına 1.400 hücre tohum ve hücre kültürü ortamında 48 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatır. 2D toplu göç tahlilini gerçekleştirirken, hücrelerin büyük bir kültür çanağında iki kuyulu silikon kesici uçlarda tohumlama genellikle görüntüleme için daha iyi hücre yoğunluğu sağlar.35 milimetrelik bir çanağa yerleştirilen küçük 3D baskılı halkalar, 2D hareketlilik analizi için de kullanılabilir. Yara onarım tahlilleri için, hücreler yüksek izdihama kadar iki kuyulu silikon uçlarda yetiştirilir. Kesici uçlar daha sonra çıkarılır ve yaraya kadar görüntülenir.MEPM yörüngeleri kalıcıdır ve hücre hareketliliğinin yönü birkaç saat boyunca korunur. Ortalama yer değiştirme ile zaman analizi, yer değiştirme biçimindeki kalıcılığın geçen zamanla orantılı olduğunu gösterir. Hareketlilik verilerinin akış analizi, birlikte hareket eden MEPM hücre kümelerinin yaklaşık 300 mikron büyüklüğünde olduğunu ortaya koymaktadır.Vahşi tip ve mutant MEPM hücreleri arasında derin bir hareketlilik farkı da gözlenir. Bu prosedür çeşitli transgenik fare çizgilerinde ve MEPM hücrelerini hücre hareketi üzerindeki etkilerini incelemek için çeşitli biyokimyasal reaktiflerle tedavi etmek için kullanılabilir. Primer palatal mezenkim hücrelerine odaklandık, ancak zaman atlamalı görüntüleme ve nicel analizler, dinamik gelişim süreçlerinde herhangi bir hareketli hücre tipinin geçiş özelliklerini araştırmak için de kullanılabilir.