4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Visuele systeemfunctie vereist de vaststelling van nauwkeurige weefsel- en orgaanstructuren. In het gewervelde oog zijn structurele defecten een veel voorkomende oorzaak van visuele beperking, maar mechanismen van oogmorfogenese worden nog steeds slecht begrepen. De basisorganisatie van het embryonale oog wordt in alle gewervelde dieren bewaard, dus levende beeldvorming van zebravisembryo's is een krachtige benadering geworden om de oogontwikkeling direct in realtime te observeren onder normale en pathologische omstandigheden. Dynamische celprocessen zoals bewegingen, morfologieën, interacties, deling en dood kunnen in het embryo worden gevisualiseerd. We hebben methoden ontwikkeld voor uniforme etikettering van subcellulaire structuren en timelapse confocale microscopie van vroege oogontwikkeling bij zebravissen. Dit protocol schetst de methode voor het genereren van gecapitpt mRNA voor injectie in het 1-cel zebravisembryo, het monteren van embryo's in het optische blaasstadium (~ 12 uur na bevruchting, hpf) en het uitvoeren van multidimensionale timelapse-beeldvorming van optische cupmorfogenese op een laserscan confocale microscoop, zodat meerdere datasets opeenvolgend worden verkregen in dezelfde beeldvormingssessie. Een dergelijke aanpak levert gegevens op die voor verschillende doeleinden kunnen worden gebruikt, waaronder celtracering, volumemetingen, driedimensionale (3D) rendering en visualisatie. Onze benaderingen stellen ons in staat om de cellulaire en moleculaire mechanismen te lokaliseren die de ontwikkeling van optische bekers stimuleren, zowel in wilde als genetische mutante omstandigheden. Deze methoden kunnen direct door andere groepen worden gebruikt of worden aangepast om veel extra aspecten van de ontwikkeling van zebravissen te visualiseren.