Imaging a 4 dimensioni della morfogenesi della coppa ottica zebrafish

La funzione del sistema visivo richiede la creazione di precise strutture di tessuti e organi. Nell'occhio dei vertebrati, i difetti strutturali sono una causa comune di disabilità visiva, ma i meccanismi della morfogenesi oculare sono ancora poco compresi. L'organizzazione di base dell'occhio embrionale è conservata in tutti i vertebrati, quindi l'imaging dal vivo degli embrioni di zebrafish è diventato un potente approccio per osservare direttamente lo sviluppo dell'occhio in tempo reale in condizioni normali e patologiche. I processi cellulari dinamici tra cui movimenti, morfologie, interazioni, divisione e morte possono essere visualizzati nell'embrione. Abbiamo sviluppato metodi per l'etichettatura uniforme delle strutture subcellulari e la microscopia confocale timelapse dello sviluppo precoce degli occhi nel pesce zebra. Questo protocollo delinea il metodo per generare mRNA tappato per iniezione nell'embrione di zebrafish a 1 cellula, montare embrioni allo stadio di vescicola ottica (~ 12 ore dopo la fecondazione, hpf) ed eseguire l'imaging timelapse multidimensionale della morfogenesi della coppa ottica su un microscopio confocale a scansione laser, in modo tale che più set di dati vengano acquisiti sequenzialmente nella stessa sessione di imaging. Tale approccio produce dati che possono essere utilizzati per una varietà di scopi, tra cui il tracciamento delle celle, le misurazioni del volume, il rendering tridimensionale (3D) e la visualizzazione. I nostri approcci ci consentono di individuare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano lo sviluppo della coppa ottica, sia in condizioni di tipo selvatico che di mutanti genetici. Questi metodi possono essere impiegati direttamente da altri gruppi o adattati per visualizzare molti aspetti aggiuntivi dello sviluppo dell'occhio di zebrafish.