Abstract
Neuroscience
Reaktive iltarter (ROS) er veletablerede signalmolekyler, som er vigtige i normal udvikling, homøostase og fysiologi. Blandt de forskellige ROS er brintoverilte (H2O2) bedst karakteriseret med hensyn til roller i cellulær signalering. H2O2 har været impliceret under udviklingen i flere arter. For eksempel er der påvist en forbigående stigning i H2O2 i zebrafiskembryoner i de første dage efter befrugtningen. Desuden nedbryder en vigtig cellulær H2O2 kilde, NADPH oxidase (NOX), forringer nervesystemet udvikling såsom differentiering, axonal vækst, og vejledning af nethinde ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode til billeddannelse intracellulær H2O2 niveauer i dyrkede zebrafisk neuroner og hele larver under udvikling ved hjælp af genetisk kodet H2O2-specifikbiosensor, roGFP2-Orp1. Denne sonde kan være forbigående eller stabilt udtrykt i zebrafisk larver. Desuden mindsker den ratiometriske udlæsning sandsynligheden for at opdage artefakter på grund af differentialgenudtryk eller volumeneffekter. For det første demonstrerer vi, hvordan man isolerer og dyrker RDC'er afledt af zebrafiskembryoner, der forbigående udtrykker roGFP2-Orp1. Derefter bruger vi hele larver til at overvåge H2O2-niveauer på vævsniveau. Sensoren er blevet valideret ved tilsætning af H2O2. Desuden kunne denne metode anvendes til at måle H2O2-niveauer i specifikke celletyper og væv ved at generere transgene dyr med vævsspecifik biosensorudtryk. Da zebrafisk fremmer genetiske og udviklingsmæssige manipulationer, kan den fremgangsmåde, der demonstreres her, tjene som en rørledning til at teste H 2 O2'srolle under neuronal og generel embryonal udvikling i hvirveldyr.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved