ROS Live Cell Imaging Under Neuronal Development

Reaktive iltarter (ROS) er veletablerede signalmolekyler, som er vigtige i normal udvikling, homøostase og fysiologi. Blandt de forskellige ROS er brintoverilte (H₂O₂) bedst karakteriseret med hensyn til roller i cellulær signalering. H₂O₂ har været impliceret under udviklingen i flere arter. For eksempel er der påvist en forbigående stigning i H₂O₂ i zebrafiskembryoner i de første dage efter befrugtningen. Desuden nedbryder en vigtig cellulær H₂O₂ kilde, NADPH oxidase (NOX), forringer nervesystemet udvikling såsom differentiering, axonal vækst, og vejledning af nethinde ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode til billeddannelse intracellulær H₂O₂ niveauer i dyrkede zebrafisk neuroner og hele larver under udvikling ved hjælp af genetisk kodet H₂O_2-specifikbiosensor, roGFP2-Orp1. Denne sonde kan være forbigående eller stabilt udtrykt i zebrafisk larver. Desuden mindsker den ratiometriske udlæsning sandsynligheden for at opdage artefakter på grund af differentialgenudtryk eller volumeneffekter. For det første demonstrerer vi, hvordan man isolerer og dyrker RDC'er afledt af zebrafiskembryoner, der forbigående udtrykker roGFP2-Orp1. Derefter bruger vi hele larver til at overvåge H₂O_2-niveauer på vævsniveau. Sensoren er blevet valideret ved tilsætning af H₂O₂. Desuden kunne denne metode anvendes til at måle H₂O_2-niveauer i specifikke celletyper og væv ved at generere transgene dyr med vævsspecifik biosensorudtryk. Da zebrafisk fremmer genetiske og udviklingsmæssige manipulationer, kan den fremgangsmåde, der demonstreres her, tjene som en rørledning til at teste H 2 O_2'srolle under neuronal og generel embryonal udvikling i hvirveldyr.