Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole di segnalazione ben consolidate, che sono importanti nello sviluppo normale, nell'omeostasi e nella fisiologia. Tra i diversi ROS, il perossido di idrogeno (H₂O₂) è meglio caratterizzato rispetto ai ruoli nella segnalazione cellulare. H₂O₂ è stato implicato durante lo sviluppo in diverse specie. Ad esempio, un aumento transitorio di H₂O_{2 è} stato rilevato negli embrioni di zebrafish durante i primi giorni successivi alla fecondazione. Inoltre, l'esaurimento di un'importante sorgente cellulare H₂O_2, la NADPH ossidasi (NOX), compromette lo sviluppo del sistema nervoso come la differenziazione, la crescita assonale e la guida delle cellule gangliari retiniche (GRGC) sia in vivo che in vitro. Qui descriviamo un metodo per l'imaging dei livelli intracellulari H₂O₂ nei neuroni zebrafish coltivati e nelle larve intere durante lo sviluppo utilizzando il biosensore specifico di H₂O₂geneticamente codificato, roGFP2-Orp1. Questa sonda può essere espressa transitoriamente o stabilmente nelle larve di zebrafish. Inoltre, la lettura ratiometrica riduce la probabilità di rilevare artefatti dovuti all'espressione genica differenziale o agli effetti di volume. In primo luogo, dimostriamo come isolare e coltura le RGC derivate da embrioni di zebrafish che esprimono transitoriamente roGFP2-Orp1. Quindi, usiamo larve intere per monitorare i livelli di H₂O₂ a livello di tessuto. Il sensore è stato convalidato con l'aggiunta di H₂O₂. Inoltre, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per misurare i livelli di H₂O₂ in specifici tipi cellulari e tessuti generando animali transgenici con espressione biosensore specifica del tessuto. Poiché i pesci zebra facilitano le manipolazioni genetiche e dello sviluppo, l'approccio dimostrato qui potrebbe servire come pipeline per testare il ruolo di H₂O_{2 durante} lo sviluppo embrionale neuronale e generale nei vertebrati.