Визуализация живых клеток ROS во время развития нейронов

Активные формы кислорода (АФК) являются хорошо зарестающимися сигнальными молекулами, которые важны для нормального развития, гомеостаза и физиологии. Среди различных АФК перекись водорода_(H2O₂₎лучше всего характеризуется в отношении ролей в клеточной сигнализации. H₂O₂ был замешан во время разработки нескольких видов. Например, преходящее увеличение_H2O₂ было обнаружено у эмбрионов рыбок данио в течение первых дней после оплодотворения. Кроме того, истощение важного клеточного источника_H2O_2, NADPH-оксидазы (NOX), ухудшает развитие нервной системы, такое как дифференцировка, рост аксонов и руководство ганглиозными клетками сетчатки (RGCs) как in vivo, так и in vitro. Здесь мы описываем метод визуализации внутриклеточных уровней_H2O₂ в культивируемых нейронах рыбок данио и целых личинках во время развития с использованием генетически закодированного_H2O_{2-специфического}биосенсора roGFP2-Orp1. Этот зонд может быть временно или стабильно экспрессирован в личинкам рыбок данио. Кроме того, ратиометрическое считывание уменьшает вероятность обнаружения артефактов из-за дифференциальной экспрессии генов или эффектов объема. Во-первых, мы демонстрируем, как изолировать и культивировать RGC, полученные из эмбрионов рыбок данио, которые временно экспрессируют roGFP2-Orp1. Затем мы используем целые личинки для мониторинга уровня H₂O₂ на тканевом уровне. Датчик был проверен добавлением H₂O₂. Кроме того, эта методология может быть использована для измерения уровней_H2O₂ в определенных типах клеток и тканей путем генерации трансгенных животных с тканеспецифической экспрессией биосенсора. Поскольку рыбки данио облегчают генетические манипуляции и манипуляции с развитием, продемонстрированный здесь подход может служить конвейером для проверки роли_H2O₂ во время нейронного и общего эмбрионального развития у позвоночных.