Abstract
Neuroscience
Активные формы кислорода (АФК) являются хорошо зарестающимися сигнальными молекулами, которые важны для нормального развития, гомеостаза и физиологии. Среди различных АФК перекись водорода(H2O2)лучше всего характеризуется в отношении ролей в клеточной сигнализации. H2O2 был замешан во время разработки нескольких видов. Например, преходящее увеличениеH2O2 было обнаружено у эмбрионов рыбок данио в течение первых дней после оплодотворения. Кроме того, истощение важного клеточного источникаH2O2, NADPH-оксидазы (NOX), ухудшает развитие нервной системы, такое как дифференцировка, рост аксонов и руководство ганглиозными клетками сетчатки (RGCs) как in vivo, так и in vitro. Здесь мы описываем метод визуализации внутриклеточных уровнейH2O2 в культивируемых нейронах рыбок данио и целых личинках во время развития с использованием генетически закодированногоH2O2-специфическогобиосенсора roGFP2-Orp1. Этот зонд может быть временно или стабильно экспрессирован в личинкам рыбок данио. Кроме того, ратиометрическое считывание уменьшает вероятность обнаружения артефактов из-за дифференциальной экспрессии генов или эффектов объема. Во-первых, мы демонстрируем, как изолировать и культивировать RGC, полученные из эмбрионов рыбок данио, которые временно экспрессируют roGFP2-Orp1. Затем мы используем целые личинки для мониторинга уровня H2O2 на тканевом уровне. Датчик был проверен добавлением H2O2. Кроме того, эта методология может быть использована для измерения уровнейH2O2 в определенных типах клеток и тканей путем генерации трансгенных животных с тканеспецифической экспрессией биосенсора. Поскольку рыбки данио облегчают генетические манипуляции и манипуляции с развитием, продемонстрированный здесь подход может служить конвейером для проверки ролиH2O2 во время нейронного и общего эмбрионального развития у позвоночных.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved