We zijn Dr. A. Cuttriss dankbaar voor haar zorgvuldige proeflezing van het manuscript. Dit werk wordt gefinancierd door de Subsidie exCHANGE van het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-16-CE13-0006) en door het CNRS.

1. Zuivering van NBD-C2Lact
OPMERKING: Hoewel dit protocol het gebruik van een celverstoorder beschrijft om bacteriën te breken, kan het worden gewijzigd om andere lysisstrategieën te gebruiken(bijvoorbeeld een Franse pers). Aan het begin van de zuivering is het verplicht om buffer te gebruiken die vers wordt ontgast, gefilterd en aangevuld met 2 mM dithiothreitol (DTT) om de oxidatie van cysteïne te voorkomen. Voor de stap voor eiwitetikettering is het echter cruciaal om ...

De uitkomsten van deze testen zijn direct afhankelijk van de signalen van de fluorescerende lipidesensoren. De zuivering van deze sondes met een verhouding van 1:1 met NBD en zonder vrije NBD-fluorofoorverontreiniging is dus een cruciale stap in dit protocol. Het is ook verplicht om te controleren of de onderzochte LTP goed is gevouwen en niet geaggregeerd. De hoeveelheid LTP die in de extractietests wordt getest, moet gelijk zijn aan of hoger zijn dan die van toegankelijke PS- of PI(4)P-moleculen om goed te kunnen meten...

De precieze verdeling van lipiden tussen verschillende membranen en binnen de membranen van eukaryote cellen1,2 heeft diepgaande biologische implicaties. Het decoderen van hoe LTP's functioneren is een belangrijke kwestie in de celbiologie3,4,5,6,en in vitro benaderingen zijn van grote waarde bij het aanpakken van dit probleem7,8,9,10,11. Hier wordt een op in vitro,fluorescentie gebaseerde strategie gepresenteerd die een belangrijke rol heeft gespeeld bij het vaststellen dat verschillende ORP / Osh-eiwitten PS / PI (4) P-uitwisseling tussen celmembranen12 beïnvloeden en daardoor een nieuwe klasse LTP's vormen. PS is een anionisch glycerofosfolipide dat 2-10% van de totale membraanlipiden in eukaryote cellenvertegenwoordigt 13,14,16. Het wordt verdeeld langs een gradiënt tussen de ER en de PM, waar het 5-7% en tot 30% van de glycerofosfolipiden vertegenwoordigt, respectievelijk17,18,19. Bovendien is PS in wezen geconcentreerd in de cytosolische bijsluiter van de PM. Deze opbouw en de ongelijke verdeling van PS in de PM zijn van cruciaal belang voor cellulaire signaleringsprocessen19. Vanwege de negatieve lading van PS-moleculen is de cytosolische bijsluiter van de PM veel anionischer dan de cytosolische folder van andere organellen1,2,19,20. Dit maakt de rekrutering mogelijk, via elektrostatische krachten, van signaaleiwitten zoals myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS)21, sarcoom (Src)22, Kirsten-rat sarcoom viral oncogene (K-Ras)23en Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1)24 die een stuk positief geladen aminozuren en een lipide staart bevatten.
PS wordt ook herkend door conventioneel eiwitkinase C op een stereoselectieve manier via een C2-domein25. PS wordt echter gesynthetiseerd in de ER26, wat aangeeft dat het naar de PM moet worden geëxporteerd voordat het zijn rol kan spelen. Het was niet bekend hoe dit werd bereikt19 tot de bevinding dat, in gist, Osh6p en Osh7p PS overbrengen van de ER naar de PM27. Deze LTP's behoren tot een evolutionair geconserveerde familie in eukaryoten waarvan het stichtende lid OSBP is en die eiwitten bevat (ORP's in de mens, Osh-eiwitten in gist) die een OSBP-gerelateerd domein (ORD) integreren met een pocket om een lipidemolecuul te hosten. Osh6p en Osh7p bestaan alleen uit een ORD waarvan de structurele kenmerken zijn aangepast om PS specifiek te binden en over te brengen tussen membranen. Niettemin was onduidelijk hoe deze eiwitten PS van de ER naar de PM overdroegen. Osh6p en Osh7p kunnen PI(4)P vangen als alternatief lipideligand12. In gist wordt PI(4)P gesynthetiseerd uit fosfatidylinositol (PI) in de Golgi en de PM door respectievelijk PI 4-kinases, Pik1p en Stt4p. Daarentegen is er geen PI(4)P in het ER-membraan, omdat dit lipide door de Sac1p-fosfatase tot PI wordt gehydrolyseerd. Daarom bestaat er een PI(4)P-gradiënt op zowel de ER/Golgi- als de ER/PM-interfaces. Osh6p en Osh7p brengen PS over van de ER naar de PM via PS/PI(4)P-uitwisselingscycli met behulp van de PI(4)P-gradiënt die bestaat tussen deze twee membranen12.
Binnen één cyclus haalt Osh6p PS uit de ER, wisselt PS in voor PI(4)P bij de PM en brengt PI(4)P terug naar de ER om een ander PS-molecuul te extraheren. Osh6p / Osh7p interageren met Ist2p28, een van de weinige eiwitten die het ER-membraan en de PM in de nabijheid van elkaar brengen om ER-PM-contactsites in gist29,30, 31te creëren. Bovendien wordt de associatie van Osh6p met negatief geladen membranen zwak zodra het eiwit een van zijn lipideliganden extraheert als gevolg van een conformatieverandering die de elektrostatische kenmerken wijzigt32. Dit helpt Osh6p door de verblijftijd van het membraan te verkorten, waardoor de efficiëntie van zijn lipidenoverdrachtsactiviteit behouden blijft. In combinatie met de binding aan Ist2p zou dit mechanisme Osh6p/7p in staat kunnen stellen om zowel snel als nauwkeurig lipidenuitwisseling uit te voeren op de ER/PM-interface. In menselijke cellen voeren ORP5- en ORP8-eiwitten PS/PI(4)P-uitwisseling uit op ER-PM-contactplaatsen via verschillende mechanismen33. Ze hebben een centrale ORD, vergelijkbaar met Osh6p, maar zijn direct verankerd aan de ER via een C-terminal transmembraansegment33 en dokken in de PM via een N-terminal Pleckstrin homologie (PH) domein dat PI(4)P en PI(4,5)P233,34,35herkent. ORP5/8 gebruikt PI(4)P om PS over te dragen, en het is aangetoond dat ORP5/8 bovendien PM PI(4,5)P2-niveaus reguleert en vermoedelijk signaleringsroutes moduleert. Op zijn beurt verlaagt een afname van PI(4)P- en PI(4,5)P2-niveaus de ORP5/ORP8-activiteit omdat deze eiwitten zich op een PIP-afhankelijke manier associëren met de PM. Abnormaal hoge PS-synthese, die leidt tot het Lenz-Majewski-syndroom, beïnvloedt PI (4) P-niveaus via ORP5 / 836. Wanneer de activiteit van beide eiwitten wordt geblokkeerd, wordt PS minder overvloedig bij de PM, waardoor het oncogene vermogen van signaaleiwitten wordt verlaagd37.
Omgekeerd lijkt ORP5-overexpressie de invasie van kankercellen en gemetastaseerde processen te bevorderen38. Veranderingen in ORP5/8-activiteit kunnen dus het cellulaire gedrag ernstig veranderen door veranderingen in lipidehomeostase. Verder bezetten ORP5 en ORP8 ER-mitochondria contactplaatsen en behouden ze enkele mitochondriale functies, mogelijk door PS39te leveren . Bovendien lokaliseert ORP5 naar ER-lipidedruppelcontactplaatsen om PS aan lipidedruppels te leveren door PS / PI (4) P-uitwisseling40. De hierin beschreven strategie om (i) PS- en PI(4)P-extractie uit liposomen en (ii) PS- en PI(4)P-transport tussen liposomen te meten, is ontwikkeld om de PS/PI(4)P-uitwisselingsactiviteit van Osh6p/Osh7p12,32 vast te stellen en te analyseren en door andere groepen gebruikt om de activiteit van ORP5/ORP835 en andere LTP's te analyseren10, 41. Het is gebaseerd op het gebruik van een fluorescentieplaatlezer, een standaard L-formaat spectrofluorometer en twee fluorescerende sensoren, NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP, die respectievelijk PS en PI (4) P kunnen detecteren.
NBD-C2Lact komt overeen met het C2-domein van het glycoproteïne, lactadherine, dat opnieuw werd ontworpen om een uniek aan oplosmiddel blootgesteld cysteïne in de buurt van de veronderstelde PS-bindingsplaats te omvatten; een polariteitsgevoelige NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluorofoor is covalent gekoppeld aan dit residu (figuur 1A)12. Om preciezer te zijn, werd het C2-domein van lactadherine (Bos taurus, UniProt: Q95114, residuen 270-427) gekloond tot een pGEX-4T3-vector om te worden uitgedrukt in fusie met glutathion S-transferase (GST) in Escherichia coli. De C2Lact-sequentie werd vervolgens gemuteerd om twee oplosmiddeltoegankelijke cysteïneresiduen (C270, C427) te vervangen door alanineresiduen en om een cysteïneresidu in te brengen in een gebied in de buurt van de vermeende PS-bindingsplaats (H352C-mutatie) dat vervolgens kan worden gelabeld met N,N'-dimethyl-N-(joodacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) ethyleendiamine (IANBD) 12. Een splitsingsplaats voor trombine is aanwezig tussen het GST-eiwit en de N-terminus van het C2-domein. Een groot voordeel is dat dit domein PS selectief herkent op een Ca2+-onafhankelijke manier in tegenstelling tot andere bekende C2-domeinen of Annexin A542. NBD-PHFAPP is afgeleid van het PH-domein van het menselijke vierfosfaat-adaptoreiwit 1 (FAPP1), dat opnieuw is ontworpen om een enkele aan oplosmiddelen blootgestelde cysteïne te bevatten die kan worden gelabeld met een NBD-groep in de buurt van de PI(4)P-bindingsplaats (Figuur 1A)43. De nucleotidesequentie van het PH-domein van het menselijke FAPP-eiwit (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) is gekloond tot een pGEX-4T3-vector die samen met een GST-tag tot expressie wordt gebracht. De PHFAPP-sequentie is aangepast om een uniek cysteïneresidu in te brengen in de membraanbindende interface van het eiwit43. Bovendien is een negenresidu-linker geïntroduceerd tussen de trombinesplitsingsplaats en de N-terminus van het PH-domein om de toegankelijkheid van het protease te waarborgen.
Om PS-extractie uit liposomen te meten, wordt NBD-C2Lact gemengd met liposomen gemaakt van fosfatidylcholine (PC) met sporenhoeveelheden PS. Vanwege de affiniteit voor PS bindt dit construct aan de liposomen en de NBD-fluorofoor ervaart een verandering in polariteit als het in contact komt met de hydrofobe omgeving van het membraan, wat een blauwverschuiving en een toename van fluorescentie opwekkendt. Als PS bijna volledig wordt geëxtraheerd door een stoichiometrische hoeveelheid LTP, associeert de sonde zich niet met liposomen en is het NBD-signaal lager (Figuur 1B)32. Dit verschil in signaal wordt gebruikt om te bepalen of een LTP(bijvoorbeeld Osh6p) PS extraheert. Een vergelijkbare strategie wordt gebruikt met NBD-PHFAPP om PI(4)P extractie te meten(Figuur 1B), zoals eerder beschreven12,32. Twee fret-gebaseerde assays werden ontworpen om (i) PS-transport van LA naar LB liposomen te meten, die respectievelijk het ER-membraan en de PM nabootsen, en (ii) PI(4)P-transport in de omgekeerde richting. Deze testen worden uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden(d.w.z. dezelfde buffer, temperatuur en lipidenconcentratie) om PS / PI (4) P-uitwisseling te meten. Om ps-transport te meten, wordt NBD-C2lact gemengd met LA liposomen samengesteld uit PC en gedopeerd met 5 mol% PS en 2 mol% van een fluorescerende rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine (Rhod-PE) - en LB liposomen met 5 mol% PI (4) P.
Op tijdstip nul dooft FRET met Rhod-PE de NBD-fluorescentie. Als PS wordt getransporteerd van LA naar LB liposomen(bijvoorbeeld bij het injecteren van Osh6p), treedt een snelle dequenching op als gevolg van de translocatie van NBD-C2Lactmoleculen van LA naar LB liposomen(Figuur 1C). Gezien de hoeveelheid toegankelijke PS blijft NBD-C2Lact in wezen in een membraangebonden toestand in de loop van het experiment12. De intensiteit van het NBD-signaal correleert dus direct met de verdeling van NBD-C2Lact tussen LA- en L B-liposomen en kan gemakkelijk worden genormaliseerd om te bepalen hoeveel PS wordt overgedragen. Om de overdracht van PI(4)P in de tegenovergestelde richting te meten, wordt NBD-PHFAPP gemengd met LA- en L B-liposomen; aangezien het alleen bindt aan L B-liposomen die PI(4)P bevatten, maar niet aan Rhod-PE, is de fluorescentie hoog. Als PI(4)P wordt overgebracht naar LA liposomen, transloceert het naar deze liposomen en neemt het signaal af als gevolg van FRET met Rhod-PE(Figuur 1C). Het signaal wordt genormaliseerd om te bepalen hoeveel PI(4)P wordt overgedragen43.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

Verschillende leden van de evolutionair geconserveerde oxysterol-bindend eiwit (OSBP) -gerelateerde eiwitten (ORP) / OSBP-homologen (Osh) -familie zijn onlangs gevonden om een nieuwe lipide transfer eiwit (LTP) -groep in gist en menselijke cellen te vertegenwoordigen. Ze brengen fosfatidylserine (PS) over van het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het plasmamembraan (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfaat (PI(4)P) uitwisselingscycli. Deze bevinding maakt een beter begrip mogelijk van hoe PS, dat van cruciaal belang is voor signaleringsprocessen, door de cel wordt verdeeld en het onderzoek naar het verband tussen dit proces en het fosfoinositide (PIP) metabolisme. De ontwikkeling van nieuwe op fluorescentie gebaseerde protocollen heeft een belangrijke rol gespeeld bij de ontdekking en karakterisering van dit nieuwe cellulaire mechanisme in vitro op moleculair niveau. Dit artikel beschrijft de productie en het gebruik van twee fluorescerend gelabelde lipidesensoren, NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP, om het vermogen van een eiwit te meten om PS of PI(4)P te extraheren en deze lipiden over te brengen tussen kunstmatige membranen. Ten eerste beschrijft het protocol hoe u zeer zuivere monsters van deze twee constructies kunt produceren, labelen en verkrijgen. Ten tweede legt dit artikel uit hoe deze sensoren met een fluorescentiemicroplaatlezer kunnen worden gebruikt om te bepalen of een eiwit PS of PI(4)P uit liposomen kan extraheren, met behulp van Osh6p als casestudy. Ten slotte laat dit protocol zien hoe de kinetiek van PS/ PI(4)P-uitwisseling tussen liposomen met gedefinieerde lipidesamenstelling nauwkeurig kan worden gemeten en hoe lipideoverdrachtssnelheden kunnen worden bepaald door fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) met behulp van een standaard fluorometer.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figuur 1: Beschrijving van de fluorescerende lipidesensoren en in vitro assays. (A) Driedimensionale modellen van NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP op basis van de kristalstructuur van het C2-domein van runderlactadherine (PDB ID: 3BN648) en de NMR-structuur van het PH-domein van het menselijke FA...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Deze methode gebruikt fluorescentie om te bepalen of een eiwit wordt overgedragen aan biologisch belangrijke liqiden tussen synthetische membraan en zo bijdragen aan de verdeling van deze lipiden in eukaryote cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de extractie en het transport van een natuurlijk lipide door een eiwit, het vereist en fluorescentiecellen en liposomen die gemakkelijk te maken zijn. Deze methode kan worden gebruikt en aangepast om inzicht te krijgen in de cellulaire biologie door eiwitten achter de verdeling van enkele essentiële lipiden tussen orgaan en membranen.Visuele demonstratie is van cruciaal belang om uit te leggen hoe real-time metingen van lipidenoverdracht door fluorescentie kunnen worden uitgevoerd. Dus de procedure zal ook Maud Magdeleine demonstreren, een ingenieur voor mijn laboratorium. Begin met het bereiden van vers gefilterde en ontgaste HEPES kaliumacetaatbuffer, aangevuld met één millimolair magnesiumchloride om HKM-buffer te vormen.Bereid vervolgens liposomen die alleen van PC zijn gemaakt of bovendien zijn gedopeerd met twee molaire procent PS of PI (4) P. Plaats nu de kolf op een roterende verdamper om het lipide onder vacuüm te drogen. Meng in één put liposomen met twee molaire procent PS met lipidensensor, NBD-C2 Lact, tot een eindconcentratie van 250 nanomolair en een volume van 100 microliter.Vul een tweede put met dezelfde hoeveelheid liposoom en NBD-C2 lact gemengd met drie micromolaire lipide transfer eiwit of LTP. Vul een derde put met 250 nanomolaire NBD-C2 lact gemengd met pure 80 micromolaire PC liposomen en een vierde put met pure 80 micromolaire PC liposomen. Herhaal deze stappen om drie extra series van vier putten voor te bereiden.Plaats vervolgens de multi-well plaat in de fluorescentielezer. Registreer voor elke put een NBD-spectrum van 505 tot 650 nanometer met een bandbreedte van vijf nanometer bij excitatie bij 490 nanometer bij 25 graden Celsius. Trek voor elke reeks het opgenomen spectrum met alleen liposomen af van de andere spectra.Bereid voor de PI(4)P extractietest liposomen gedopeerd met twee molaire procenten fosfatidylinositol-4-fosfaat en voer metingen uit met de NBD-PH FAPP-sonde. Voer controle-experimenten uit en bepaal het extractiepercentage. Na het afwerken vullen liposomen een buisje Met deze geëxtrudeerde liposomen.Bereid vers ontgaste en gefilterde HKM-buffer en bewaar de buizen met geëxtrudeerde liposomen op kamertemperatuur. Wikkel tubes met liposomen met rhodamine gelabeld fosfatidylethanolamine in aluminiumfolie en bewaar ze in een ondoorzichtige doos om fotobleking te voorkomen. Stel de temperatuur in tussen 25 en 37 graden Celsius en pas de excitatiemonochromemeters aan op 460 nanometer met een korte bandbreedte van één tot drie nanometer en emissie op 530 nanometer met een grote bandbreedte van meer dan 10 nanometer.Stel de acquisitietijd in op vijfentwintig minuten met de tijdresolutie van maximaal één seconde. Verdun in het kwartscuvet 30 microliter van de LA liposoomsuspensie en NBD-C2 lactbouillonoplossing en voorwarm HKM-buffer om een monster van 570 microliter te bereiden dat 200 micromolaire totale lipiden en 250 nanomolaire of NBD-C2 lact bevat. Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe en plaats de cuvette in de fluorometerhouder.Zodra het monster thermisch in evenwicht is, activeert u de meting. Voeg na één minuut 30 microliter van de LB liposoomsuspensie toe aan het monster. Injecteer na drie minuten LTP in het monster zodat de uiteindelijke concentratie van de LTP 200 nanomolair is en verwerf vervolgens het signaal gedurende de resterende 21 minuten.Voer een parallel experiment uit om het NBD-signaal te normaliseren. Meng 30 microliter LA-evenwichtsliposoomsuspensie met 250 nanomolaire NBD-C2 lact in HKM-buffer bij een eindvolume van 570 microliter. Injecteer na één minuut 30 microliter LB-evenwichtsliposoomsuspensie.Converteer de kinetische curven gemeten met een LTP van belang om de hoeveelheid PS te bepalen die in de loop van de tijd van LA naar LB liposomen wordt overgedragen. Normaliseer vervolgens elk gegevenspunt van de curve. Voer het PI(4)P-experiment uit met dezelfde instellingen en omstandigheden voor de vloerstraler als voor de PS-overdrachtstest.Meng in de cuvette 30 microliter lb liposoomsuspensie en NBD-PH FAPP-sonde met voorverwarmde HKM-buffer om een eindvolume van 570 microliter te verkrijgen. Zodra de thermische evenwichtslibratie van het monster is bereikt, start u de meting. Injecteer na één minuut 30 microliter LA liposoom suspensie.Injecteer na drie minuten de LTP van belang en neem het signaal op. Voer een tweede experiment uit om het NBD-signaal te normaliseren. Meng 30 microliter lb evenwicht liposoom suspensie met 250 nanomolaire NBD-PH FAPP en 570 microliter HKM-buffer.Injecteer na één minuut 30 microliter LA-evenwichtsliposoomsuspensie. Converteer de kinetische curven om de hoeveelheid PI(4)P te bepalen die in de loop van de tijd van LB naar LA liposomen wordt overgedragen en normaliseer vervolgens elk gegevenspunt. Om te kwantificeren in hoeverre een LTP efficiënt is.Voer een lineaire regressie uit van de eerste gegevenspunten van de overdrachtskinetiek om een helling te verkrijgen. Deel de hellingswaarde door de LTP-concentratie in het reactiemengsel om het aantal lipidemoleculen te bepalen dat per eiwit per tijdseenheid wordt overgedragen. Efficiënte terugwinning van C2-lact uit de kralen werd geverifieerd met SDS-pagina-analyse.Het ultraviolette zichtbare absorberende spectrum van C2-lact gelabeld met NBD bevestigde dat alle C2-lactmoleculen waren gelabeld met een NBD-groep. De zuiverheid van NBD-C2 lact en de fluorescentie ervan werden bepaald door SDS-pagina-analyse. De fluorescentie van NBD-C2 lact of NBD-PH FAPP was maximaal wanneer alleen liposomen met PS of PI(4)P werden gebruikt voor incubatie, wat aangeeft dat de sensor membraangebonden was.Een lage fluorescentie werd gezien toen Osh6p ook aanwezig was, wat aangeeft dat dit eiwit efficiënt PS of PI(4)P uit liposomen heeft geëxtraheerd. De resultaten van een PS-overdrachtstest met Osh6p als LTP worden weergegeven. De gemiddelde kinetische curven van PS-overdracht van LA-liposomen naar LB-liposomen, gedopeerd of niet gedopeerd met fosfatidylinositol-4-fosfaat werden berekend.De gemiddelde initiële PS-transportsnelheid werd bepaald aan de hand van drie verschillende experimenten. Evenzo worden hier resultaten weergegeven van een PI(4)P-overdrachtstest met Osh6p als LTP. Samen met de gemiddelde kinetische curven verkregen na signaalnormalisatie.Gemiddelde overdrachtssnelheden werden gemeten met LA-liposomen die wel of niet gedopeerd waren met PS. Gebruik bij het uitvoeren van dit protocol verse buffer en bereid dezelfde dagen voor. Minimaliseer de lichtexpositie van fluorescerende liposomen en eiwitten, gebruik goed gezuiverde NBD-gelabelde eiwitten en houd ze op ijs. kan worden bevestigd door ps- en pi(4)p-overdracht tussen organel in de prokaryote cel te meten met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende lipidesensoren.Deze techniek effent een weg naar een beter begrip van PS en PI(4) zijn verdeeld in de cel, en hun activiteit ondergaan specificiteit van verschillende LTPS.