Abstract
Biochemistry
Flera medlemmar av den evolutionärt bevarade oxysterolbindande protein (OSBP)-relaterade proteiner (ORP)/OSBP homologs (Osh) familjen har nyligen visat sig representera en ny lipid överföring protein (LTP) grupp i jäst och mänskliga celler. De överför fosfatidylserin (PS) från endoplasma retikulum (ER) till plasmamembranet (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfat (PI(4)P) utbytescykler. Detta fynd möjliggör en bättre förståelse för hur PS, som är avgörande för signalprocesser, distribueras i hela cellen och undersökningen av sambandet mellan denna process och fosfoinositid (PIP) metabolism. Utvecklingen av nya fluorescensbaserade protokoll har varit avgörande för upptäckten och karakteriseringen av denna nya cellulära mekanism in vitro på molekylär nivå. Detta dokument beskriver produktion och användning av två fluorescerande märkta lipidsensorer, NBD-C2Lact och NBD-PHFAPP, för att mäta ett proteins förmåga att extrahera PS eller PI(4)P och överföra dessa lipider mellan konstgjorda membran. Först beskriver protokollet hur man producerar, märker och hämtar hög renhetsprover av dessa två konstruktioner. För det andra förklarar detta dokument hur man använder dessa sensorer med en fluorescens microplate läsare för att avgöra om ett protein kan extrahera PS eller PI(4)P från liposomer, med Osh6p som en fallstudie. Slutligen visar detta protokoll hur man exakt mäter kinetiken i PS/PI(4)P utbyte mellan liposomer av definierad lipidsammansättning och för att bestämma lipidöverföringshastigheter genom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) med hjälp av en standardfluorometer.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved