Vi är tacksamma mot dr A. Cuttriss för hennes noggranna korrekturläsning av manuskriptet. Detta arbete finansieras av det franska nationella forskningsorganet ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) och av CNRS.

1. Rening av NBD-C2Lakt
OBS: Även om detta protokoll beskriver användningen av en cellstörare för att bryta bakterier, kan det ändras för att använda andra lysstrategier(t.ex. en fransk press). I början av reningen är det obligatoriskt att använda buffert som är nyavgasad, filtrerad och kompletterad med 2 mM dithiothreitol (DTT) för att förhindra oxidation av cystein. För proteinmärkningssteget är det dock viktigt att helt ta bort DTT. Många steg måste utfö...

Resultaten av dessa analyser förlitar sig direkt på signalerna från fluorescerande lipidsensorer. Reningen av dessa sonder märkta med ett 1:1-förhållande med NBD och utan gratis NBD-fluorforförorening är därför ett kritiskt steg i detta protokoll. Det är också obligatoriskt att kontrollera om det ltp som är under granskning är korrekt vikt och inte aggregerat. Mängden LTP som testas i extraktionsanalyserna måste vara lika med eller högre än mängden tillgängliga PS- eller PI(4)P-molekyler för att korr...

Den exakta fördelningen av lipider mellan olika membran och i membranen i eukaryota celler1,2 har djupgående biologiska konsekvenser. Dekryptera hur LTPs fungerar är en viktig fråga icellbiologi 3,4,5,6, och in vitro-metoder är av stort värde för att ta itu med denna fråga7,8,9,10,11. Här presenteras en in vitro,fluorescensbaserad strategi som har bidragit till att fastställa att flera ORP/Osh-proteiner påverkar PS/PI(4)P utbyte mellan cellmembran12 och därmed utgör en ny klass av LTPs. PS är en anjonisk glycerophospholipid som representerar 2-10% av de totala membranlipiderna i eukaryotaceller 13,14,16. Det fördelas längs en gradient mellan akuten och statsministern, där den representerar 5-7% och upp till 30% av glycerophospholipids,respektive 17,18,19. Dessutom är PS i huvudsak koncentrerat till statsministerns cytosoliska broschyr. Denna uppbyggnad och den ojämna partitionen av PS i PM är avgörande för cellulära signalprocesser19. På grund av den negativa laddningen av PS-molekyler är statsministerns cytosoliska broschyr mycket mer anjonisk än den cytosolliska broschyren från andra organeller1,2,19,20. Detta möjliggör rekryteringen, via elektrostatiska krafter, av signalproteiner som myristoylated alanin-rika C-kinas substrat (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rat sarkom viral oncogene (K-Ras)23, och Ras-relaterade C3 botulinum toxin substrat 1 (Rac1)24 som innehåller en sträcka av positivt laddade aminosyror och en lipid svans.
PS känns också igen av konventionella proteinkinas C på ett stereoselectivt sätt via en C2-domän25. PS syntetiseras dock i ER26, vilket indikerar att det måste exporteras till statsministern innan det kan spela sin roll. Det var inte känt hur detta uppnåddes19 förrän konstaterandet att i jäst, Osh6p och Osh7p överföra PS från AKUT till PM27. Dessa LTPs tillhör en evolutionärt bevarad familj i eukaryoter vars grundande medlem är OSBP och som innehåller proteiner (ORPs i mänskliga, Osh proteiner i jäst) integrera en OSBP-relaterad domän (ORD) med en ficka för att vara värd för en lipidmolekyl. Osh6p och Osh7p består endast av ett ORD vars strukturella egenskaper är anpassade för att specifikt binda PS och överföra den mellan membran. Hur dessa proteiner riktade ps från akuten till statsministern var dock oklart. Osh6p och Osh7p kan fånga PI(4)P som en alternativ lipid ligand12. I jäst syntetiseras PI(4)P från fosfatidylinositol (PI) i Golgi och PM med PI 4-kinaser, Pik1p respektive Stt4p. Däremot finns det ingen PI(4)P i ER-membranet, eftersom denna lipid hydrolyseras till PI av Sac1p fosfatas. Därför finns det en PI(4)P-lutning vid både ER/Golgi- och ER/PM-gränssnitten. Osh6p och Osh7p överför PS från akuten till pm via PS/PI(4)P utbytescykler med pi(4)P-lutningen som finns mellan dessa tvåmembran 12.
Inom en cykel extraherar Osh6p PS från akuten, byter PS mot PI(4)P vid pm och överför PI(4)P tillbaka till akuten för att extrahera en annan PS-molekyl. Osh6p/ Osh7p interagerar med Ist2p28, ett av de få proteiner som ansluter och föra ER-membranet och statsministern i närheten av varandra för att skapa ER-PM kontaktplatser i jäst29,30,31. Dessutom blir associeringen av Osh6p med negativt laddade membran svag så snart proteinet extraherar en av sina lipidligander på grund av en konformationsförändring som ändrar dess elektrostatiska egenskaper32. Detta hjälper Osh6p genom att förkorta dess membranboende tid och därigenom upprätthålla effektiviteten i dess lipidöverföringsaktivitet. I kombination med bindningen till Ist2p kan denna mekanism göra det möjligt för Osh6p/7p att både snabbt och korrekt utföra lipidutbyte vid ER/PM-gränssnittet. I mänskliga celler utför ORP5- och ORP8-proteiner PS/PI(4)P-utbyte på ER-PM-kontaktplatser via distinktamekanismer 33. De har ett centralt ORD, som liknar Osh6p, men är direkt förankrade på akuten via ett C-terminalt transmembransegment33 och dockar in i PM via en N-terminal Pleckstrin homology (PH) domän som känner igen PI(4)P och PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 använder PI(4)P för att överföra PS, och det har visat sig att ORP5/8 dessutom reglerar PM PI(4,5)P2-nivåer och förmodligen modulerar signalvägar. En minskning av PI(4)P och PI(4,5)P2-nivåerna sänker i sin tur ORP5/ORP8-aktiviteten eftersom dessa proteiner associeras med statsministern på ett PIP-beroende sätt. Onormalt hög PS syntes, som leder till Lenz-Majewski syndrom, påverkar PI(4)P nivåer genom ORP5/836. När aktiviteten hos båda proteinerna blockeras blir PS mindre riklig vid statsministern, vilket sänker den onkogena förmågan att signalera proteiner37.
Omvänt verkar ORP5 överuttryck främja cancercellsinvasion och metastaserande processer38. Således kan förändringar av ORP5/8 aktivitet allvarligt ändra cellulärt beteende genom förändringar i lipid homeostas. Vidare upptar ORP5 och ORP8 ER-mitokondrier kontaktplatser och bevarar vissa mitokondriella funktioner, eventuellt genom att leverera PS39. Dessutom lokaliserar ORP5 till ER-lipid droppe kontaktplatser för att leverera PS till lipid droppar av PS / PI (4) P utbyte40. Den strategi som beskrivs häri för att mäta i) PS- och PI(4)P-extraktion från liposomer och ii) PS- och PI(4)P-transport mellan liposomer har utarbetats för att upprätta och analysera PS/PI(4)P-utbytesaktiviteten för Osh6p/Osh7p12,32 och används av andra grupper för att analysera verksamheten hos ORP5/ORP835 och andra LTP10, 41. I artikel 3.1 i eu Den är baserad på användningen av en fluorescensplatta läsare, en standard L-format spektrofluorometer, och två fluorescerande sensorer, NBD-C2Lact och NBD-PHFAPP, som kan upptäcka PS respektive PI(4)P.
NBD-C2Lact motsvarar C2-domänen för glykoprotein, laktadin, som återengineererades för att inkludera en unik lösningsmedelsexponerad cystein nära det förmodade PS-bindningsstället. En polaritetskänslig NBD-fluorofor (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) är kovalst kopplad till dessa rester(figur 1A)12. För att vara mer exakt klonades C2-domänen av laktadin (Bos taurus, UniProt: Q95114, rester 270-427) till en pGEX-4T3 vektor som ska uttryckas i fusion med glutation S-transferase (GST) i Escherichia coli. C2-laktsekvensen muterades sedan för att ersätta två lösningsmedelsanpassade cysteinrester (C270, C427) med alaninrester och för att föra in en cysteinrester i en region nära det förmodade PS-bindande området (H352C-mutationen) som senare kan märkas med N,N'-dimetyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etylendiamine (IANBD) 12. En klyvningsplats för trombin finns mellan GST-proteinet och N-ändstationen för C2-domänen. En stor fördel är att detta område selektivt erkänner PS på ett Ca2 +-oberoende sätt som strider mot andra kända C2-domäner eller Annexin A542. NBD-PHFAPP kommer från PH-domänen för det humana fyrafosfatadapterproteinet 1 (FAPP1), som återinträdes för att inkludera en enda lösningsmedelsexponerad cystein som kan märkas med en NBD-grupp nära PI(4)P-bindningsstället(figur 1A)43. Nukleotidsekvensen för PH-domänen för det mänskliga FAPP-proteinet (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) har klonats till en pGEX-4T3-vektor som ska uttryckas tillsammans med en GST-tagg. PHFAPP-sekvensen har modifierats för att sätta in en unik cysteinrester i proteinets membranbindningsgränssnitt43. Dessutom har en länk med nio rester införts mellan trombinklyvningsstället och PH-domänens N-ändstation för att säkerställa tillgängligheten till proteasen.
För att mäta PS-extraktion från liposomer, NBD-C2Lakt blandas med liposomer av fosfatidylkolin (PC) som innehåller spårmängder av PS. På grund av dess affinitet för PS binder denna konstruktion till liposomerna, och NBD-fluorforen upplever en förändring i polaritet när den kommer i kontakt med membranets hydrofobiska miljö, som framkallar ett blått skift och en ökning av fluorescensen. Om PS extraheras nästan helt med en stoichiometrisk mängd LTP associeras sonden inte med liposomer, och NBD-signalen är lägre (figur 1B)32. Denna skillnad i signal används för att avgöra om en LTP(t.ex. Osh6p) extraherar PS. En liknande strategi används med NBD-PHFAPP för att mäta PI(4)P-extraktion (figur 1B), som beskrivitstidigare 12,32. Två FRET-baserade analyser utformades för att i) mäta PS-transport från LA till L B-liposomer, som efterliknar ER-membranet respektive PM- och ii) PI(4)P-transporten i motsatt riktning. Dessa analyser utförs under samma förhållanden(dvs. samma buffert, temperatur och lipidkoncentration) för att mäta PS/PI(4)P-utbyte. För att mäta PS-transport blandas NBD-C2Lact med L A-liposomer bestående av PC och dopad med 5 mol% PS och 2 mol% av en fluorescerande rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin (Rhod-PE)-och LB-liposomer som innehåller 5 mol% PI(4)P. 
Vid noll tidpunkt, FRET med Rhod-PE quenches NBD fluorescens. Om PS transporteras från LA till L B-liposomer(t.ex. vid injektion av Osh6p) sker en snabb utsläckning på grund av flyttningen av NBD-C2Laktmolekyler från LA till LB-liposomer (figur 1C). Med tanke på mängden tillgänglig PS förblir NBD-C2Lact i huvudsak i ett membranbundet tillstånd under experimentetsgång 12. Således korrelerar NBD-signalens intensitet direkt med fördelningen av NBD-C2-laktmellan LA- och LB-liposomer och kan enkelt normaliseras för att avgöra hur mycket PS som överförs. För att mäta överföringen av PI(4)P i motsatt riktning blandas NBD-PHFAPP med LA- och L B-liposomer. Med tanke på att det endast binder till L B-liposomer som innehåller PI(4)P, men inte Rhod-PE, är dess fluorescens hög. Om PI(4)P överförs till L A-liposomer, flyttar den till dessa liposomer och signalen minskar på grund av FRET med Rhod-PE (Figur 1C). Signalen normaliseras för att avgöra hur mycket PI(4)P överförs43.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;L-cysteine &#8805;97 % (FG)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W326305-100G</td>
			<td>Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W224681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm-diameter glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z265934-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA purifier</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC900324, UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa</td>
			<td>Merck</td>
			<td>UFC800324, UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Gold Competent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0 Liss&#160; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C16:0-PI(4)P&#160;&#160;</td>
			<td>Echelon Lipids</td>
			<td>P-4016-3</td>
			<td>Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 &#181;L of MeOH and 250 &#181;L of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C-500mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Disruptor</td>
			<td>Constant Dynamics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>438601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized (Milli-Q) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide (DMF), anhydrous, &#62;99% pure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td>Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.&#160; Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac chromatography columns (1.5 &#215; 12 cm).</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette 2 mm</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>EP102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Eppendorf 2510</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Spinning the batcerial lysates</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (10, 25, and 50 &#181;L) for fluorescence experiment</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 &#181;L) to handle lipid stock solutions</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0756-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (99% pure)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemolysis tubes with a cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES , &#62;99 % pure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra NAP 10 desalting column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE17-0854-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0008-B</td>
			<td>Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Acetate</td>
			<td>Prolabo</td>
			<td>26664.293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth medium without glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared with milli-Q water and autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MeOH) &#8805;99.8%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20847.24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 &#181;m filter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator-based fluorescence plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>M1000 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N&#39;-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 &#181;L in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 &#176;C in the dark.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p5318-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-C2LACT&#160; plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-PHFAPP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available on request from our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) &#8805;98.5% (GC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626-25g</td>
			<td>Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoramidon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7385-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 &#181;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7311550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prefilters (10 mm in diameter).</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>http://pymol.org/</td>
			<td></td>
			<td>Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 &#181;L)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvettes</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge&#160; Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic PFTE stirring bar (5 &#215; 2 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO orange</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10602400001</td>
			<td>Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 &#181;L aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, ultra pure</td>
			<td>MP</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge L90K</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible absorbance spectrophotometer</td>
			<td>SAFAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device</td>
			<td>Jasco or Shimadzu</td>
			<td>Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based measurements of phosphatidylserine/phosphatidylinositol 4-phosphate exchange between membranes

Flera medlemmar av den evolutionärt bevarade oxysterolbindande protein (OSBP)-relaterade proteiner (ORP)/OSBP homologs (Osh) familjen har nyligen visat sig representera en ny lipid överföring protein (LTP) grupp i jäst och mänskliga celler. De överför fosfatidylserin (PS) från endoplasma retikulum (ER) till plasmamembranet (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfat (PI(4)P) utbytescykler. Detta fynd möjliggör en bättre förståelse för hur PS, som är avgörande för signalprocesser, distribueras i hela cellen och undersökningen av sambandet mellan denna process och fosfoinositid (PIP) metabolism. Utvecklingen av nya fluorescensbaserade protokoll har varit avgörande för upptäckten och karakteriseringen av denna nya cellulära mekanism in vitro på molekylär nivå. Detta dokument beskriver produktion och användning av två fluorescerande märkta lipidsensorer, NBD-C2Lact och NBD-PHFAPP, för att mäta ett proteins förmåga att extrahera PS eller PI(4)P och överföra dessa lipider mellan konstgjorda membran. Först beskriver protokollet hur man producerar, märker och hämtar hög renhetsprover av dessa två konstruktioner. För det andra förklarar detta dokument hur man använder dessa sensorer med en fluorescens microplate läsare för att avgöra om ett protein kan extrahera PS eller PI(4)P från liposomer, med Osh6p som en fallstudie. Slutligen visar detta protokoll hur man exakt mäter kinetiken i PS/PI(4)P utbyte mellan liposomer av definierad lipidsammansättning och för att bestämma lipidöverföringshastigheter genom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) med hjälp av en standardfluorometer.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figur 1: Beskrivning av fluorescerande lipidsensorer och in vitro-analyser. (A) Tredimensionella modeller av NBD-C2Lakt och NBD-PHFAPP baserat på kristallstrukturen i C2-domänen för bovint laktadin (PDB-ID: 3BN648)och NMR-strukturen i PH-domänen för det mänskliga FAPP1-proteinet (P...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes at JoVE.com

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Här beskriver vi protokoll med fluorescerande lipidsensorer och liposomer för att avgöra om ett protein extraherar och transporterar fosfatidylserin eller fosfatidylinositol 4-fosfat in vitro.

Fluorescensbaserade mätningar av fosfatidylserin/fosfatidylinositol 4-fosfatutbyte mellan membran

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Denna metod använder fluorescens för att avgöra om ett protein överförs till biologiskt viktiga liqider mellan syntetiskt membran och därmed bidra till fördelningen av dessa lipider inuti eukaryota celler. Denna teknik gör det möjligt att extrahera och transportera en naturlig lipid av ett protein, det kräver och fluorescensceller och liposomer som är lätta att göra. Denna metod kan användas och modifieras för att få insikt i cellbiologi genom proteiner bakom fördelningen av några viktiga lipider mellan organ och membran.Visuell demonstration är avgörande för att förklara hur man utför realtidsmätningar av lipidöverföring genom fluorescens. Så att demonstrera proceduren kommer också att vara Maud Magdeleine, en ingenjör för mitt laboratorium. Börja med att förbereda färsk filtrerad och avgasad HEPES kaliumacetatbuffert, kompletterad med en millimolär magnesiumklorid för att bilda HKM-buffert.Förbered sedan liposomer endast gjorda av PC eller dessutom dopade med två molar procent PS eller PI(4)P. Placera kolven på en roterande förångare för att torka lipiden under vakuum. Blanda liposomer som innehåller två molar procent PS med lipidsensor, NBD-C2 Lact, i en brunn till en slutlig koncentration på 250 nanomolar och en volym på 100 mikroliter.Fyll en andra brunn med samma mängd liposom och NBD-C2-lakt blandat med tre mikromolar lipidöverföringsprotein eller LTP. Fyll en tredje brunn med 250 nanomolar NBD-C2 lakt blandat med rena 80 mikromolar PC liposomer och en fjärde brunn med rena 80 mikromolar PC liposomer. Upprepa dessa steg för att förbereda ytterligare tre serier med fyra brunnar.Placera sedan multibrunnsplattan i fluorescensläsaren. För varje brunn registrera ett NBD-spektrum från 505 till 650 nanometer med en bandbredd på fem nanometer vid excitation vid 490 nanometer vid 25 grader Celsius. För varje serie subtrat spektrumet registreras med endast liposomer från andra spektra.För PI(4)P extraktionsanalysen bereda liposomer dopade med två molar procent fosfatidylinositol-4-fosfat och utför mätningar med NBD-PH FAPP sonden. Utför kontroll experiment och bestäm utsugs procentsatsen. Efter avslutad extruderande liposomer fyll ett rör med dessa extruderade liposomer.Förbered nyförgasad och filtrerad HKM-buffert och håll rören som innehåller extruderade liposomer vid rumstemperatur. Linda rör som innehåller liposomer med rhodaminmärkt fosfatidyletanolamin i aluminiumfolie och förvara dem i en ogenomskinlig låda för att förhindra fotoblekning. Ställ in temperaturen mellan 25 och 37 grader Celsius och justera excitationsmonkrommetrarna till 460 nanometer med en kort bandbredd på en till tre nanometer och utsläpp till 530 nanometer med en stor bandbredd på mer än 10 nanometer.Ställ in förvärvstiden på tjugofem minuter med tidsupplösningen högst en sekund. I kvarts cuvette späd 30 mikroliter av LA liposom suspension och NBD-C2 lakt lagerlösning och prewarm HKM buffert för att förbereda ett 570 mikroliter prov som innehåller 200 mikromolar totala lipider och 250 nanomolar eller NBD-C2 lakt. Tillsätt en liten magnetisk omrörningsstång och placera cuvetten i fluorometerhållaren.När provet är termiskt jämvikt utlöser mätningen. Efter en minut, tillsätt 30 mikroliter av LB-liposomupphängningen i provet. Efter tre minuter injicera LTP i provet så att den slutliga koncentrationen av LTP är 200 nanomolar och sedan förvärva signalen under de återstående 21 minuterna.Utför ett parallellt experiment för att normalisera NBD-signalen. Blanda 30 mikroliter LA jämviktsliposomupphängning med 250 nanomolar NBD-C2-lakt i HKM-buffert med en slutlig volym på 570 mikroliter. Efter en minut, injicera 30 mikroliter LB jämvikt liposom suspension.Konvertera de kinetiska kurvorna mätta med en LTP av intresse för att bestämma mängden PS som överförs från LA till LB-liposomer över tid. Normalisera sedan varje datapunkt i kurvan. Utför PI(4)P-experimentet med samma inställningar och villkor för golvemitteraren som för PS-överföringsanalysen.Blanda 30 mikroliter lb liposomfjädring och NBD-PH FAPP-sond med förvärmd HKM-buffert i cuvetten för att få en slutlig volym på 570 mikroliter. När provet har uppnåtts börjar du mäta. Efter en minut, injicera 30 mikroliter LA liposom suspension.Efter tre minuter injicerar du LTP av intresse och spelar in signalen. Utför ett andra experiment för att normalisera NBD-signalen. Blanda 30 mikroliter lb equilibrium liposomupphängning med 250 nanomolar NBD-PH FAPP och 570 mikroliter HKM-buffert.Efter en minut, injicera 30 mikroliter LA jämvikt liposom suspension. Konvertera de kinetiska kurvorna för att bestämma mängden PI(4)P som överförs från LB till LA-liposomer över tid och normalisera sedan varje datapunkt. För att kvantifiera i vilken utsträckning en LTP är effektiv.Utför en linjär regression av de första datapunkterna i överföringskinetiken för att få en lutning. Dividera lutningsvärdet med LTP-koncentrationen i reaktionsblandningen för att bestämma antalet lipidmolekyler som överförs per protein och tidsenhet. Effektiv återvinning av C2 lakt från pärlor verifierades med SDS sida analys.Ultraviolett synliga absorberande spektrum av C2 lakt märkt med NBD bekräftade att alla C2 lakt molekyler var märkta med en NBD grupp. Renheten hos NBD-C2 lakt och dess fluorescens fastställdes av SDS sida analys. Fluorescensen av NBD-C2 lakt eller NBD-PH FAPP var maximal när endast liposomer som innehåller PS eller PI(4)P användes för inkubation, vilket indikerar att sensorn var membranbunden.En låg fluorescens sågs när Osh6p också var närvarande som indikerar att detta protein effektivt extraheras PS eller PI(4)P från liposomer. Resultaten från en PS-överföringsanalys med Osh6p som LTP visas. De genomsnittliga kinetiska kurvorna för PS överföring från LA liposomer till LB liposomer, dopade eller inte dopade med fosfatidylinositol-4-fosfat beräknades.Den genomsnittliga initiala PS-transporthastigheten fastställdes från tre olika experiment. På samma sätt visas resultat från en PI(4)P överföringsanalys med Osh6p som LTP här. Tillsammans med de genomsnittliga kinetiska kurvor som erhålls efter signalnormalisering.Genomsnittliga överföringshastigheter mättes med LA-liposomer som var dopade eller inte dopade med PS. När du utför det här protokollet använder du ny buffert och förbereder samma dagar. Minimera ljusutläggning av florescenta liposomer och proteiner, använd väl renat NBD-märkt protein och håll dem på is. kan bekräftas genom att ps- och PI(4)P-överföring mäts mellan organell inuti prokaryota celler med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande lipidsensorer.Denna teknik banar väg för en bättre förståelse av PS och PI(4)fördelas inom cellen, och deras aktivitet genomgår specificitet av flera LTPS.