Abstract
Neuroscience
Başlangıçta Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilen doku hidrojel delipidasyon yöntemi (CLARITY), kalın beyin örneklerinin immünostainasyonu ve görüntülenmesi için değiştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu ileri teknoloji henüz tam montajlı retinalar için kullanılmamıştır. Retina kısmen şeffaf olmasına rağmen, yaklaşık 200 μm kalınlığı (farelerde) hala antikorların derin dokuya nüfuzunu sınırlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Burada, protein kaybını en aza indirmek ve doku hasarını önlemek için akrilamid monomer ile polimerleştirerek nanoporöz bir hidrojel oluşturmak ve daha sonra sodyum dodecyl sülfatta temizlemek için tüm mount fare retinaları için CLARITY yöntemini uyarladık. CLARITY ile işlenmiş retinalar, retina nöronları, glial hücreler ve sinaptik proteinler için antikorlarla immünostain edildi, kırılma indeksi eşleştirme çözeltisine monte edildi ve görüntülendi. Verilerimiz CLARITY'nin retina nöronları ve glial hücreler için standart immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme kalitesini tam montajlı hazırlıkta artırabileceğini göstermektedir. Örneğin, dopaminerjik amakrin hücrelerin ince akson benzeri ve dendritik yapılarının 3D çözünürlüğü CLARITY tarafından çok daha iyi hale getirildi. İşlenmemiş tam montajlı retinalarla karşılaştırıldığında CLARITY, postinaptik yoğunluk proteini 95 gibi sinaptik proteinler için immünostaining ortaya çıkarabilir. Sonuçlarımız, CLARITY'nin lipitlerin çıkarılmasından sonra retinayı daha optik olarak şeffaf hale getirdiğini ve retina nöronlarının ve proteinlerinin ince yapılarını koruduğunu ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının tüm montajlı preparat içinde yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için rutin olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved