インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

ミオシンタンパク質は、フィラメントアクチン(F-アクチン)と結合して相互作用し、系統樹全体の生物に見られる。その構造と酵素特性は、細胞内で実行される特定の機能に適合しています。ミオシン5aは、細胞内のメラノソームおよび小胞を輸送するためにF-アクチンをプロセス的に歩く。逆に、非筋筋筋筋2bは、約30分子を含む双極性フィラメントとして動作する。これは、フィラメントの中心に向かって反対極性のF-アクチンを移動し、そこでミオシン分子がアクチンを結合し、パワーストロークを与え、サイクルを繰り返す前に解震するために非同期的に働く。非筋筋筋筋2bは、その他の非筋筋筋2アイソフォームと共に、細胞接着、サイトカネシス、および張力維持を含む役割を有する。ミオシンのメカノケミストリーは、精製タンパク質を用いたインビトロ運動性アッセイを行うことで研究できる。滑空アクチンフィラメントアッセイでは、ミオシンは顕微鏡カバースリップ表面に結合し、蛍光標識されたF-アクチンを転写し、追跡することができます。しかし、単一分子/アンサンブル運動アッセイでは、F-アクチンはカバースリップに結合し、F-アクチン上の蛍光標識ミオシン分子の動きが観察される。本報告では、親和クロマトグラフィーを用いた Sf9 細胞からの組換えミオシン5aの精製について概説する。これに続いて、2つの蛍光顕微鏡ベースのアッセイ:滑空アクチンフィラメントアッセイと反転運動アッセイの概要を説明します。これらのアッセイから、画像解析ソフトウェアを用いてアクチン転位速度や単一分子の実行長さや速度などのパラメータを抽出することができます。これらの技術はまた、非筋筋ミオシン2イソフォームの単一フィラメントの動きを研究するために適用することができ、非筋筋筋2bの文脈で本明細書で議論される。このワークフローは、非筋肉ミオシンの単一分子およびアンサンブルダイナミクスを研究するために使用できるプロトコルと定量的ツールのセットを表します。