Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

Le domaine de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) se développe rapidement avec de nouveaux équipements et algorithmes de traitement, produisant des structures à plus haute résolution et des informations sur des systèmes plus difficiles. La préparation des échantillons pour le cryo-EM connaît une révolution similaire avec de nouvelles approches en cours de développement pour remplacer les systèmes de transfert traditionnels. Il s’agit notamment de l’utilisation de distributeurs piézo-électriques, de l’impression d’épingles et de la pulvérisation directe. À la suite de ces développements, la vitesse de préparation de la grille passe de quelques secondes à quelques millisecondes, offrant de nouvelles opportunités, en particulier dans le domaine de la cryo-EM à résolution temporelle où les protéines et les substrats peuvent être rapidement mélangés avant la congélation en plongée, piégeant les états intermédiaires de courte durée. Nous décrivons ici, en détail, un protocole standard pour la fabrication de grilles sur notre dispositif EM interne à résolution temporelle à la fois pour la préparation rapide standard de la grille et également pour les expériences résolues dans le temps. Le protocole exige un échantillon d’environ 50 μL à des concentrations de ≥ 2 mg/mL pour la préparation de 4 grilles. Le délai entre l’application de l’échantillon et la congélation peut être aussi bas que 10 ms. L’une des limites est l’augmentation de l’épaisseur de la glace à des vitesses plus rapides et par rapport à la méthode de buvardage. Nous espérons que ce protocole aidera d’autres personnes à concevoir leurs propres dispositifs de fabrication de grilles et ceux qui s’intéressent à la conception d’expériences résolues dans le temps.