Rask nettforberedelse for tidsavklart kryo-elektronmikroskopi

Feltet kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) utvikler seg raskt med nye maskinvare- og prosesseringsalgoritmer, og produserer strukturer og informasjon med høyere oppløsning på mer utfordrende systemer. Prøvepreparering for cryo-EM gjennomgår en lignende revolusjon med nye tilnærminger som utvikles for å erstatte de tradisjonelle blottingssystemene. Disse inkluderer bruk av piezo-elektriske dispensere, pintrykk og direkte sprøyting. Som et resultat av denne utviklingen går hastigheten på nettforberedelsene fra sekunder til millisekunder, noe som gir nye muligheter, spesielt innen tidsavsluttet kryo-EM der proteiner og substrater raskt kan blandes før dykkfrysing, fanger kortvarige mellomliggende tilstander. Her beskriver vi i detalj en standardprotokoll for å lage rutenett på vår interne tidsavklarte EM-enhet både for standard rask nettforberedelse og også for tids løste eksperimenter. Protokollen krever minimum ca. 50 μL prøve ved konsentrasjoner på ≥ 2 mg/ml for fremstilling av 4 gitter. Forsinkelsen mellom prøveprogram og frysing kan være så lav som 10 ms. En begrensning er økt istykkelse ved raskere hastigheter og sammenlignet med blottingsmetoden. Vi håper denne protokollen vil hjelpe andre med å designe sine egne grid making enheter og de som er interessert i å designe tidsavklarte eksperimenter.