تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 DK123292، T32 DK108736، UC4 DK104194، UG3 DK122638، وP01 AI042288. وقد أجريت هذه البحوث بدعم من شبكة المتبرعين أعضاء البنكرياس مع مرض السكري (nPOD; RRID:SCR_014641)، وهو مشروع بحثي تعاوني من النوع 1 لمرض السكري برعاية JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)، وليونا م. وهاري ب. هيلمسلي الخيرية الاستئمانية (غرانت #2018PG-T1D053). المحتوى والآراء التي أعرب عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية للnPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) بالشراكة مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. شكرا للدكتور كيفن أوتو، جامعة فلوريدا، لتوفير هزاز المستخدمة لتوليد شرائح الماوس.

ملاحظات: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية باستخدام الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فلوريدا (201808642). تم الحصول على أقسام البنكرياس البشري من المتبرعين بالأنسجة من كلا الجنسين عن طريق شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD) بنك الأنسجة، جا?...

<ol>
	<li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders.">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes.">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li><li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+diabetes:+etiology+and+reversibility.">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li><li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases.">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li><li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology.">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li><li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology.">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li><li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells.">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li><li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis.">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).</li><li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis.">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li><li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes.">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li><li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration.">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).</li><li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunction+of+persisting+&#946;+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis.">Dysfunction of persisting &#946; cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).</li><li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology.">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li><li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+in+translational+biomedical+research.">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li><li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses.">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li><li>Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).</li><li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine,+porcine,+and+bovine+islets.">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices.">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li><li>G&#225;l, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice.">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).</li><li>Sto&#382;er, A., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Sto&#382;er, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices.">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).</li><li>Fr&#252;h, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization.">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).</li><li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion.">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations.">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li><li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ.">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2012).</li></ol>

الهدف من هذا البروتوكول هو شرح توليد شرائح البنكرياس والإجراءات اللازمة لتوظيف شرائح في الدراسات الوظيفية والمناعية. هناك العديد من الفوائد لاستخدام شرائح البنكرياس الحية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تعتبر ضرورية للأنسجة لتبقى قابلة للحياة ومفيدة خلال بروتوكولات التج?...

مشاركة البنكرياس هو pathognomonic لأمراض مثل التهاب البنكرياس, T1D, و T2D1,2,3. دراسة وظيفة في الجزر المعزولة وعادة ما ينطوي على إزالة الجزر من البيئة المحيطة بها4. تم تطوير طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية للسماح لدراسة أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للجزر سليمة وتجنب استخدام إجراءات عزل الجزر المجهدة5،6،7. وقد استخدمت بنجاح شرائح أنسجة البنكرياس من الأنسجة المانحة البشرية لدراسة T1D وأظهرت عمليات فقدان خلايا بيتا والخلل الوظيفي بالإضافة إلى تسلل الخلايا المناعية8,9,10,11,12,13. يمكن تطبيق طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية على كل من أنسجة البنكرياس الماوس والإنسان5,6,8. يتم الحصول على شرائح أنسجة البنكرياس البشرية من الأنسجة المانحة للأعضاء من خلال التعاون مع شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD). يمكن إنشاء شرائح الماوس من مجموعة متنوعة من سلالات الماوس المختلفة.
سيركز هذا البروتوكول على إعادة دمج السكري غير البدين لتفعيل الجينات-1-null (NOD. Rag1-/-) ومستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) سلالات الماوس. موافقه. راغ1/- الفئران غير قادرة على تطوير الخلايا T و B بسبب اضطراب في الجين تنشيط إعادة التركيب 1 (Rag1)14. موافقه. Rag1-/-. تستخدم الفئران AI4 α/β كنموذج لمرض السكري من النوع 1 المتسارع لأنها تنتج استنساخ خلية T واحدة تستهدف سطح الأنسولين ، مما يؤدي إلى تسلل جزيرة ثابتة وتطور سريع للأمراض15. يصف البروتوكول المعروض هنا إجراءات الدراسات الوظيفية والمناعية باستخدام شرائح البنكرياس البشرية والفأرة الحية من خلال تطبيق نهج المجهر الكونفوكوكال. وتشمل التقنيات الموصوفة هنا تقييمات الجدوى، وتحديد الجزيرة وموقعها، وتسجيلات Ca2+ السيتوسوليك، فضلا عن تلطيخ وتحديد مجموعات الخلايا المناعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#3 Style Scalpel Handle</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP299-100</td>
			<td>HEPES Buffer, 1M Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Untreated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>301029</td>
			<td>BD Syringe with Luer-Lok Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD 305109</td>
			<td>BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverglass-bottom Petri dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chambered coverglass</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>199898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>CaCl2 (dihydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Digital Rocker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Pinhole&#8201;= 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512&#8201;&#215;&#8201;512 pixel resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>C6H12O6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddiH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 35 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather No. 10 Surgical Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7204410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluo-4-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Control Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>45198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>C8H18N2O4S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-395-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC 14043-704-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-7440</td>
			<td>&#160;Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34705</td>
			<td>Kimtech Science&#8482; Kimwipes&#8482; Delicate Task Wipers, 2-Ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td>This kit contains the calcein-AM live cell dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td>MgCl2 (hexahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>MgSO4 (heptahydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Heated Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PM-1</td>
			<td>Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>GE</td>
			<td>JES1460DSWW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 Paintbrush</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>10269140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td>Imaging chamber for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overnight imaging chamber</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201-LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20012050</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-labeled insulin tetramer</td>
			<td>Emory Tetramer Research Core</td>
			<td>sequence YAIENYLEL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71998</td>
			<td>For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque low melting-point agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50101</td>
			<td>To make agarose for slice generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchor (dynamic imaging)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>NaH2PO4 (monohydrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522-1G</td>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Adapter</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SA-20MW-AL</td>
			<td>To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>H201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>IC90 E MSV266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S34857</td>
			<td>blue-fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357575</td>
			<td>Falcon&#8482; Plastic Disposable Transfer Pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Control System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VCS-8</td>
			<td>System for dynamic stimulation recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td>Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices

شرائح أنسجة البنكرياس الحية تسمح لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وظيفة في سياق محيط جزيرة صغيرة سليمة. يتم إعداد شرائح من أنسجة البنكرياس البشرية والفأرة الحية جزءا لا يتجزأ من agarose وقطع باستخدام هزاز. تسمح هذه الطريقة للأنسجة بالحفاظ على مقومات البقاء والوظيفة بالإضافة إلى الحفاظ على الأمراض الأساسية مثل النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D). طريقة شريحة تمكن اتجاهات جديدة في دراسة البنكرياس من خلال الحفاظ على الهياكل المعقدة والتفاعلات بين الخلايا المختلفة التي تشكل الغدد الصماء والأنسجة الخارجية للبنكرياس. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تلطيخ ومجهر الفاصل الزمني للخلايا المناعية الذاتية الحية داخل شرائح البنكرياس جنبا إلى جنب مع تقييمات فسيولوجيا الجزيرة. علاوة على ذلك ، يمكن صقل هذا النهج لتمييز مجموعات الخلايا المناعية المحددة لمضادات خلايا الجزيرة باستخدام الكواشف المعقدة متعددة ال مرسلات الهستوباتية الرئيسية.

هذا البروتوكول سوف تسفر شرائح أنسجة البنكرياس الحية مناسبة لكل من الدراسات وظائف وتسجيلات الخلايا المناعية. تظهر شريحة المظهر في كل من brightfield وتحت الضوء المنعكس في الشكل 1A، B. كما نوقش، يمكن العثور على الجزر في شرائح باستخدام الضوء المنعكس بسبب زيادة الحبيبية الت?...

Watch this Scientific Journal Video about Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.

مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

سيساعد بروتوكولنا في الإجابة على تأثير تفاعلات الخلايا المناعية على وظائف الجزيرة. طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية يسمح لعلم وظائف الأعضاء الجزيرة ووظيفة لدراسة مع الحفاظ على الأنسجة الكامنة وراء الأمراض والبيئة الدقيقة الأصلية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على عمليات المرض لأمراض البنكرياس، مثل التهاب البنكرياس، ومرض السكري من النوع الأول، ومرض السكري من النوع الثاني.للبدء، ترتيب الكتل على حامل العينة بطريقة لا تتجاوز عرض النصل، وضمان أن النصل يمكن أن تتحرك إلى الأمام أقل مسافة ممكنة عندما يتحرك هزاز ببطء. تطبيق خط من الغراء السوبر على حامل العينة، مما يجعل طبقة رقيقة باستخدام نهاية موزع الغراء، ثم الوجه كتل الأنسجة على الغراء بحيث الجانب القريب من الأنسجة يواجه صعودا. دفع بلطف أسفل الكتل والسماح للغراء الجاف لمدة ثلاث دقائق.بعد ذلك ، قم بتوصيل اللوحة بالهزاز مع المسمار وضبط ارتفاع النصل والمسافة التي يتم قطعها بحيث يتحرك النصل على طول الكتل وبالكاد فوقها. دفع بلطف كتل مع ملقط للتأكد من أن الغراء قد جفت، ومن ثم ملء صينية هزاز مع محلول خارج الخلية المبردة حتى يتم تغطية النصل. تعيين هزاز لجعل شرائح من سمك 120 ميكرومتر والبدء فيه، ثم مراقبة شرائح الخروج من كتل الأنسجة.رفع شرائح عندما تطفو قبالة كتلة عن طريق وضع فرشاة الطلاء أو ملقط تحتها ووضع شرائح في العازلة بيكربونات كريبس رينغر التي تحتوي على ثلاثة ملليمولار D-الجلوكوز ومثبطات تريبسين. ضع اللوحات التي تحتوي على الشرائح على الروك واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة في 25 دورة في الدقيقة. إذا كانت الشرائح تحتاج إلى الاحتفاظ بها لفترة أطول، ضع الشرائح في 15 ملليلتر من شريحة الثقافة المتوسطة ووضع لوحة في حاضنة.احتضان الشرائح المعدة في 37 درجة مئوية للدراسات في نفس اليوم أو نقل الشرائح التي يتم استزراعها في 24 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجربة. قم بتشغيل المجهر قبل ساعة واحدة على الأقل من التسجيل وتوازن حاضنة المرحلة العليا إلى 37 درجة مئوية. تأمين غطاء الزجاج أسفل طبق بيتري التي تحتوي على شريحة على خشبة المسرح.ركز المجهر عن طريق وضع هدف 10X في وضع brightfield وحدد موقع الجزر باستخدام وضع الحقل الساطع من خلال البحث عن بيضاويات برتقالية اللون اللون داخل الشريحة. قم بتبديل المجهر إلى التصوير البؤري عن طريق الضغط على زر CS على وحدة تحكم الشاشة التي تعمل باللمس بالمجهر. لعرض الجزر باستخدام العاكسة، قم بتشغيل كاشف الليزر 638 وكاشف PMT.تعيين طاقة الليزر بين واحد و 2٪وإيقاف مرشحات الشق. استخدم ليزر 405 نانومتر وكاشف PMT لمراقبة بقعة الحمض النووي. الكاشف الهجين للكشف عن الأجسام المضادة CD8 وكاشف الليزر والهجين 488 نانومتر لعرض رباعي الأنسولين.مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. بمجرد أن تقع جزيرة ذات أهمية ، قم بالتبديل إلى هدف 20X وتكبيرها بحيث تشغل الجزيرة معظم الإطار. اتخاذ z-كومة من الجزيرة، ثم العثور على أفضل المقاطع البصرية حيث إلى الخلايا على قيد الحياة وأي الخلايا المناعية المحيطة بها هي في التركيز.قم بتعيين المجهر للتسجيل في وضع XYZT وتحسين الإعدادات لتسجيل كومة z من الخطوات المحددة كل 20 دقيقة على مدى عدة ساعات. تم تصور الجزر في شريحة أنسجة البنكرياس باستخدام برايتفيلد وعكس المجهر الخفيف. الأنسولين في الجزر يزيد من التفاصيل ويسبب امتصاص كميات كبيرة من الضوء المنعكس، مما يزيد من رؤية الجزر.تم تقييم صلاحية شريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية عن طريق التلطيخ. ويشار إلى الخلايا الحية باللون الأخضر والخلايا الميتة باللون الأزرق. مؤشر إيجابي آخر لقابلية البقاء هو النشاط القاعدي الملحوظ.عندما تم تحميل شريحة البنكرياس الحية مع مؤشر الكالسيوم نفاذية الخلية, لوحظ تحفيز الجلوكوز في كل من الماوس وشرائح البنكرياس البشري. كما تم قياس مضان الخلايا الفردية أثناء تحفيز الجلوكوز كميا. لوحظت الجزر السليمة والمرضى باستخدام تلطيخ dithizone وينعكس المجهر الخفيف.الجزر المريضة تبدأ في فقدان الحبيبية بسبب تسلل الخلايا المناعية وموت الخلايا. يمكن التعرف على مجموعات الخلايا المناعية باستخدام الأجسام المضادة CD8 وتلطيخ رباعي الأنسولين. يشير التلطيخ المشترك إلى أن الخلايا هي خلية تي تأثيرية تستهدف على وجه التحديد مستضد الأنسولين.الشيء الأكثر أهمية أن نتذكر في هذا الإجراء هو الحفاظ على شرائح في الحلول مثبطات بروتياز في جميع الأوقات. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء العديد من الوظائف في تجارب الخلايا المناعية مما يسمح بدراسة تأثير تفاعلات الخلايا المناعية ووظيفة الجزيرة.