עבודה זו נתמכה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) to MMAB, by Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA to MMAB and by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - קוד פיננסי 001. CG-C קיבל מלגת תואר שני ודוקטורט מ- CAPES ו- LAMT-S קיבל מלגת דוקטורט מ- CNPq. אנו מודים לאליזבטה ר. מילאני על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית וד"ר דריו זמבוני על אספקת תאי LLC-MK2 (בית הספר לרפואה ריבייראו פרטו, USP).

1. תרביות תאים וטפילים
<ol><li>לגדל LLC-MK2 (רזוס קוף אפיתל הכליות) תאים מאוסף תרבית סוג אמריקאי (CCL-7) בבקבוק תרבית תאים 25 cm2 cm2 המכיל במדיום RPMI בתוספת 10% FBS מושבת בחום (סרום בקר עוברי) ואנטיביוטיקה (100 U / mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) ב 37 °C ב 5% CO2 17.</li>
	<li>להדביק תאי LLC...

<ol>
	<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses.">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li><li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions:+basic+concepts+of+microbial+commensalism,+colonization,+infection,+and+disease.">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li><li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number.">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).</li><li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation.">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li><li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+natural+antibodies.">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>T&#243;th, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).</li><li>Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-colour+fluorescent+imaging+of+lymphoid+tissue+based+on+colour+addition+theory.">Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory.</a> Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).</li><li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting.">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).</li><li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species.">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).</li><li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling.">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).</li><li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species.">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).</li><li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription.">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li><li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., M&#233;ndez-Vilas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antibodies+from+the+same+host+species+in+double+labeling+immunofluorescence+on+trypanosome+cytoskeleton.">Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton.</a> Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).</li><li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1,+LLC-MK2,+and+LLC-MK2+(NCTC-3196)+and+their+utility+in+virus+research.">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li><li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li><li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Trypanosoma+cruzi:+Host+Cell+Interaction.">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).</li><li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion.">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li><li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton.">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li><li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins.">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li><li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila.">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li><li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hnRNP+A1:+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression.">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li><li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+subclasses+and+allotypes:+from+structure+to+effector+functions.">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).</li></ol>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע חיסונים כפולים בתאים נגועים טריפנוסומה קרוזי באמצעות שני נוגדנים שונים מאותו מין מארח. כדי ללמוד, בפירוט רב יותר, את ההשלכות של הזיהום, מבנים בתא המארח כגון הגרעין או אברונים ציטוטוסוליים ניתן לתייג באמצעות פרוטוקול זה. כמו כן, ניתן להשתמש בו בשיטת התוו...

כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן עם התא המארח ברמה התאית מספק מידע חיוני על הגורמים הבסיסיים של המחלה מאז קבוצות שונות, כגון וירוסים, חיידקים, פרוטוזואה, יכול להדביק את רוב סוגי התא המארח1,2,3,4. זה יכול גם לעזור לפתח ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות שיכולות להאט או לעכב את הצמיחה של הפתוגן. בתנאים חיים, הנוגדנים המיוצרים אחראים לזיהוי רכיבים עצמיים, אנטיגנים מווירוסים, רכיבים או מוצרים חיידקיים, פטריות, טפילים ואחרים5.
לשם כך, נוגדנים הם כלים בשימוש נרחב, בעיקר להבנת המיקום והתפקוד של מבנים וחלבונים תאיים. מספר מחקרים באמצעות תיוג נוגדנים מרובים מדגימים כי צעדי חסימה נוספים תורמים לספציפיות של האימונולוקליזציה. בנוסף, רוב הפרוטוקולים המתוארים משתמשים בנוגדנים חד שבטיים מסחריים ספציפיים, כולל נוגדנים מאותו מין מארח6,7,8,9,10,10,11,12,13,14.
בדרך כלל, תיוג כפול immunofluorescence משתמש בשני נוגדנים שגדלו במינים שונים כדי להכתים את מבני התא של עניין או את הפתוגנים ואת התאים המארחים כדי לראות את האינטראקציה ביניהם. עם זאת, זו יכולה להיות בעיה כאשר אין נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים ספציפיים עבור פתוגנים מסוימים זמינים לביצוע התיוג הכפול. כמו כן, ישנן ערכות הטיות נוגדנים זמינות מסחרית, וניתן להטות את הנוגדנים העיקריים ישירות לפלואורופור על ידי תגובת אסתר סוצ'ינימידיל15. הבעיה היא כי ערכות אלה הם לעתים קרובות יקרים, ויש צורך מספיק נוגדנים כדי לתייג אותם. בידיעה זו, פיתחנו בהצלחה שיטה אימונופלואורסצנטית כפולה באמצעות שני נוגדנים שונים שגדלו באותו מין כדי לחקור לוקליזציה של חלבון ב- Trypanosoma brucei16. עם זאת, עבור טפילים תאיים, כולל טריפנוסומה קרוזי, גישה זו לא הודגמה. כאן, אנו מראים כיצד לבצע תיוג כפול immunofluoreorescence ללמוד טפילים תאיים T. cruzi ואת התא המארח באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו המין ללא תגובות צולבות. מלבד שיטה זו, תיוג אימונופלואורסצנטי משולש הוקם עם הוספת הנוגדן השלישי ממין אחר. גישות אלה מסייעות כאשר מקור הנוגדנים מוגבל וניתן להשתמש בהן בכל סוג תא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch, USA</td>
			<td>315-005-003</td>
			<td>Anti-mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A11017</td>
			<td>Goat anti mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 IgG1 antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21125</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab&#39;)2 (H+L) antibody</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A21237</td>
			<td>Goat anti-mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>R4528</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody</td>
			<td>Our lab</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Mouse antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td>Albumin protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>I3021</td>
			<td>Nonionic Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade with DAPI</td>
			<td>Life technologies, USA</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Mounting media reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1X with L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T4049-100ML</td>
			<td>Bioreagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double labeling immunofluorescence using antibodies from the same species to study host-pathogen interactions

כיום, ניתן למצוא מגוון רחב של כלים מולקולריים הזמינים לחקר אינטראקציות תא טפיל-מארח. עם זאת, קיימות מגבלות מסוימות כדי להשיג נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים המזהים מבני תאים וחלבונים ספציפיים בטפילים. חוץ מזה, יש כמה נוגדנים מסחריים זמינים לתייג טריפנוסומטידים. בדרך כלל, נוגדנים פוליקלונליים נגד טפילים מוכנים בתוך הבית ויכולים להיות מאתגרים יותר לשימוש בשילוב עם נוגדנים אחרים המיוצרים באותו מין. כאן, הפרוטוקול מדגים כיצד להשתמש בנוגדנים פוליקלונליים ומונו-שבטיים שגדלו באותו מין כדי לבצע תיוג כפול immunofluorescence לחקור אינטראקציות תא מארח ופתוגן. כדי להשיג את התיוג הכפול immunofluorescence, זה חיוני כדי לדגור תחילה את הנוגדן הפוליקלונלי עכבר ולאחר מכן בצע את הדגירה עם העכבר המשני IgG נוגדן מצומד לכל פלואורוכרום. לאחר מכן, יש צורך בצעד חסימה נוסף כדי למנוע כל זכר לנוגדן העיקרי להיות מוכר על ידי הנוגדן המשני הבא. לאחר מכן, נוגדן מונוקלונלי של עכבר ונוגדן המשני הספציפי של IgG התת-מחלקה שלו מצומדים לפלורוכרום שונה מתווספים לדגימה בזמנים המתאימים. בנוסף, ניתן לבצע תיוג משולש immunofluorescence באמצעות נוגדן שלישי שגדל במין אחר. כמו כן, מבנים כגון גרעינים ו actin יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם תרכובות ספציפיות שלהם או תוויות. לכן, גישות אלה המוצגות כאן ניתן להתאים עבור כל תא שמקורות הנוגדנים העיקריים שלו מוגבלים.

כאן, אנו מראים כיצד לחקור אינטראקציות מארח-טפיל על ידי immunofluorescence כאשר מקור הנוגדנים מוגבל בשל חוסר זמינות של נוגדנים מסחריים המזהים מבנים וחלבונים ספציפיים טריפנוסומטידים.
בין טריפאנוסומטידים, T. cruzi יש אחד ממחזורי החיים המורכבים ביותר מעורבים שלבי התפתחות שונים בין ב...

Watch this Scientific Journal Video about Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו מין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן. כמו כן, הוא יכול לכלול את הנוגדן השלישי ממארח אחר בפרוטוקול זה. גישה זו יכולה להתבצע בכל סוג תא ופתוגנים.

תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשני נוגדנים מאותו פונדקאי יחד בבדיקת האימונופלואורסצנטיות כדי לחקור אינטראקציות בין תאים מארחים ופתוגנים. מכיוון שיש רק מעט נוגדנים מסחריים הזמינים לזיהוי מבני תאים וחלבונים ספציפיים בטפילים, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי מאוד. זהו פרוטוקול אימונופלואורסצנטי קל לביצוע בעל תיוג כפול המשתמש בנוגדנים פוליקלונליים ומונו-שבטיים הגדלים באותו מין.חוקרים רבים עשויים להיות מודעים לכך שזה אפשרי. גישה זו מסייעת כאשר מקור הנוגדנים מוגבל. זה יכול לשמש כדי לזהות את הפתוגנים בחלבוני התא המארח בתאים המארחים נגועים והוא יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים חיים חופשיים.זהו פרוטוקול פשוט, דורש צעד חסימה אחד בין זוג הנוגדנים הראשון והשני. ההליך יוצג על ידי ד"ר קמילה גאצ'ט-קסטרו והדוקטורנטית ליס טריאנו-סילבה מהמעבדה שלי. שלושה ימים לאחר הדבקת תאי LLC-MK2 עם טריפנוזומה קרוזי, לאסוף את supernatant מהתאים הנגועים בצינור חרוטי תרבית תא 15 מיליליטר.צנטריפוגה המדגם כדי להוריד את פסולת התא, ולאחר מכן למקם את הצינור בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את trypomastigotes לשחות אל supernatant. לאחר 10 דקות, לאסוף את supernatant בצינור חרוטי חדש, ולאחר מכן צנטריפוגה המדגם להשליך את supernatant לפני resususpending את הכדור המכיל את הטפילים במדיום RPMI מלא. הוסף תאי LLC-MK2 בלוחות של 24 בארות המכילים כיסויים מעוגלים מעוקרים UV ולאפשר ל- the&m להסתפק במשך 16 שעות.לאחר מכן כדי להדביק את התאים, להוסיף supernatant המכיל T.Cruzi לכל באר ודגרו במשך שש שעות. לאחר מכן, לשטוף את כיסויים המכילים את התאים הנגועים והלא נגועים חמש פעמים עם PBS, ולאחר מכן לתקן את התאים עם 2% paraformaldehyde ב PBS. לאחר 10 דקות, לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם PBS ולאחר מכן לחלחל את כיסוי עם חומר ניקוי לא יוני במשך 10 דקות.לאחר שלוש שטיפת PBS של חמש דקות, דגירה של כיסויים בתמיסת חסימה במשך 30 דקות, ואחריה דגירה נוספת של 30 דקות עם נוגדן חד שבטי או פוליקלונלי של עכבר. לאחר שטיפת PBS, לדגור על כיסוי במשך 30 דקות עם נוגדן משני בחסימת פתרון phalloidin כדי להכתים חוטי אקטין בתא המארח. לאחר מכן לשטוף את כיסויים עם PBS שלוש פעמים שוב לפני החלת כמות קטנה של ריאגנט הרכבה אנטי עמעום עם מדיום DAPI על פני השטח של השקופית.באמצעות מלקחיים, הטה בעדינות את כיסוי הכיסוי במדיום כדי למנוע היווצרות בועות. עבור תיוג כפול, לאחר הדגירה של כיסויים בתמיסת חסימה כפי שהוכח בעבר, לדגור אותם בנוגדן פוליקלונלי העכבר במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם PBS לפני הדגירה אותם עם הנוגדן המשני במשך 30 דקות.לאחר מכן בעקבות שלוש שטיפות PBS, לבצע שלב חסימה שני עם ארנב AffiniPure אנטי עכבר IgG מדולל בתמיסת חסימה. לאחר 30 דקות, לשטוף את כיסוי עם PBS שוב לפני הדגירה אותם עם הנוגדן monoclonal העכבר במשך 30 דקות נוספות. לאחר מכן, לאחר שלוש שטיפת PBS, לדגור על כיסוי עם עז אנטי עכבר IgG 2B נוגדן ו phalloidin.לאחר מכן, לאחר שלוש שטיפות PBS, החל ריאגנט הרכבה נגד עמעום כפי שהוכח בעבר. עבור תיוג משולש, לאחר חסימת כיסוי כיסוי ודגרה עם נוגדן פוליקלונלי העכבר, ואחריו נוגדן נגד עכבר עזים, להתחיל דגירה חדשה עם נוגדן פוליקלונלי ארנב בחסימת פתרון במשך 30 דקות. ואז אחרי שלוש שטיפת PBS, לדגור על כיסוי עם נוגדן נגד ארנב עזים במשך 30 דקות.לאחר מכן, לאחר שלוש שטיפות PBS, לבצע שלב חסימה עם AffiniPure ארנב נגד עכבר נוגדן מדולל פתרון חסימה במשך 30 דקות. לאחר מכן לשטוף את כיסויים שוב לפני הדגירה עם כל נוגדן IgG חד שבטי עכבר במשך 30 דקות. לאחר שלוש שטיפות PBS, דגירה את כיסוי כיסוי במשך 30 דקות עם זוג ספציפי של עז נגד עכבר IgG נוגדנים מתחת למחלקה.לאחר הדגירה, לשטוף את כיסוי שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם PBS. נתח את דגימות האימונופלואורסצנט באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת טבילה בשמן פי 63 וזיהה את הפלואורסצנטיות באמצעות שפופרת פוטומולופייר וגלאי היברידי. לאחר מכן רכשו את כל התמונות הקונפוקליות בערוצים מופרדים ובצעו עיבוד תמונה באמצעות Adobe Photoshop.תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות אלה מראות תוצאות עם ניסויי בקרה של תאים נגועים ולא נגועים המדגישים את הספציפיות של הנוגדנים בתא המארח ואת הטפיל המופנם. הנוגדן הפוליקלונלי נגד טריפנוזומה קרוזי FAZ זיהה את החלבון הענק T.cruzi באזור ההתקשרות עם הפלגלום של הטפיל, אך לא בתא המארח. הפצת ריבונוקלאופרוטאין גרעיני הטרוגניים A1 בגרעינים נצפתה באמצעות נוגדן חד שבטי עכבר מסחרי המזהה רק את תאי היונקים המארחים, אך לא את הטפיל.כמו כן, גרעין המארח והטפיל והקינטופלסטים הטפילים היו מוכתמים ב- DAPI והמארח F-actin היה מוכתם בפאלאואידין הצמיד לאלקסה 594, המאשר את הספציפיות של הנוגדנים. תיוג כפול של אימונופלואורסצנטיות מראה את התפלגות החלבון בפונדקאי ואת הטפיל המנותח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התיוג לא הציע תגובה צולבת בין נוגדנים באמצעות מתודולוגיה זו.לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן מציג טכניקה בסיסית ומורכבת שניתן להתאים לכל שילוב של נוגדנים. גישה זו הופכת את immunofluorescence לחסכוני ויכולה לעזור ללמוד את הלוקליזציה של שני חלבונים או יותר של עניין כאשר מעט נוגדנים זמינים.

תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן

Abstract