מחקר זה נתמך כספית על ידי המרכז לאימונולוגיה של מערכות אנושיות עם קרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1113682) וקרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1211043). ג.M.M נתמך על ידי מלגת בוגרי סטנפורד ומלגת סטנפורד ביו-אקס ויליאם ולינדה לנווט. A.K.G. הוא אסיר תודה על מלגת מחקר בוגרי הקרן הלאומית למדע ומלגת Gabilan של מלגת בוגר סטנפורד למדע והנדסה. S.C נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר F32CA247352. המחברים גם רוצים להכיר בחום חברי מעבדת אפל כולל ד"ר גילי רות, ד"ר אנתוני יו, ד"ר לינדזי סטייפלטון, ד"ר הקטור לופז הרננדז, ד"ר אנדריאה ד 'אקינו, ד"ר ג'ולי Baillet, סלין ליונג, בן או, אמילי מייני, אמילי גייל וד"ר אנטון סמית על המאמץ והזמן שלהם לעזור מעבדת אפל לפתח פרוטוקולים אלה לאורך השנים.

למחברים האלה אין מה לחשוף.

הידרוג'לים פולימריים-ננו-חלקיקיים (PNP) מיוצרים בקלות ומאפשרים אספקה מקומית ארוכת טווח של תאים ותרופות טיפוליים באמצעות ניהול זעיר פולשני באמצעות הזרקה ישירה או משלוח קטטר. פרוטוקולים אלה מתארים את ניסוח הידרוג'לים PNP ואת שיטות האפיון להבטחת איכות החומרים וכתוצאה מכך. הידרוג'ל PNP סופראמולקולרי ניתנים לייצור ונוצרים באמצעות ערבוב פשוט של פולימרים תאיים מותאמים וננו-חלקיקי קליפת ליבה פולימריים. השיטות הנוכחיות מתארות נהלים פשוטים ליצירת ג'לים טעונים מראש במזרקים באמצעות פרוטוקולי ערבוב מרפקים פשוטים. באמצעות מדדי בקרת איכות של כל אחד מחלקי הרכיבים, כגון DLS לניטור הגודל וההפצה של NP, ניתן לנסח באופן משחזר חומרי הידרוג'ל PNP בעלי תכונות ראולוגיות עקביות. באמצעות שינוי הכמות של HPMC-C12 או NPs, ניתן לווסת את גודל רשת שינוי נוקשות של הידרוג'ל PNP וכתוצאה מכך. מאפיינים אלה יכולים להיות מכווננים בצורה הטובה ביותר כדי להתאים בצורה הטובה ביותר ליישום ביו-רפואי מסוים, ועם השיטות הריאולוגיות המפורטות כאן החוקרים יכולים לאפיין את תכונות דילול הגזירה וריפוי עצמי של הידרוג'לים PNP כפי שהם לייעל את הפלטפורמה עבור היישומים הספציפיים שלהם. שיטות למחקרי שחרור במבחנה מתוארות גם; חוקרים יכולים להשתמש במחקרים אלה כדי לאפיין את ציר הזמן היחסי של שחרור תרופות מעניינות, ליידע את העתיד במחקרים vivo. באמצעות מחקרי יציבות, החוקרים יכולים גם להעריך את היכולת של חומרים אלה כדי לסייע בשמירה על המבנה הביולוגי והיציבות של biotherapeutics רגיש לאורך זמן ומזג אוויר קיצוני, עם יישומים פוטנציאליים משכנעים כדי להפחית את התלות בשרשרת הקור של biotherapeutics. לבסוף, עם מבחני כדאיות תאים פשוטים, ניתן להעריך צמיחת תאים והגירה בתוך חומרי PNP, עם יישומים פוטנציאליים בטיפולים ופיגומים בתאים.
הקבוצה שלנו מצאה יישומים משכנעים רבים עבור פלטפורמת הידרוג'ל PNP27. הידרוג'לים PNP שימשו לאספקה איטית של חיסונים subunit, המאפשר פרופילי שחרור קינטי תואם של אנטיגנים ואדג'ובנטים כדי להגביר את הגודל, משך, ואיכות התגובה החיסונית הומוריסטי31. הידרוג'לים PNP נמצאו יש גודל רשת קטן יותר מאשר הידרוג'לים הנפוצים ביותר, ולכן הם יעילים בהאטת דיפוזיה לאט משחרר מטען מולקולרי. תכונות דבקות הרקמה הייחודית ואת המאפיינים המכניים של הידרוג'לים PNP נוצלו גם כדי ליצור מחסומים פיזיים כדי למנוע הידבקויות הנובעות מניתוח על ידי ריסוס הידרוג'לים על פני שטח גדולים של איברים לאחר ניתוח30. הידרוג'לים PNP הוכחו גם להיות כלי רכב יעילים אספקת תאים, ואת המאפיינים המכניים למעשה להגן על התאים מפני הכוחות המכניים המתרחשים מחט המזרק במהלך ההזרקה, שיפור הכדאיות התא29. כאשר NPs הם מצומדים עם פפטיד דבק תאים, תאים יכולים לצרף ולעסוק עם מטריצת PNP להישאר קיימא. באמצעות גישה זו, הידרוג'לים PNP הוכחו לשפר את השמירה המקומית של תאי גזע מוזרקים לעומת שיטות באמצעות כלי רכב נוזליים28. בנוסף, הידרוג'לים PNP הוכחו למנוע הצטברות תרמית של אינסולין encapsulated, אפילו בתנאי הזדקנות לחוצים קשים, מה שמרמז כי חומרים אלה עשויים להיות מסוגלים להפחית את הצורך בקירור תרופות רגישות לטמפרטורה38.
בסך הכל, המתודולוגיות המתוארות כאן יאפשרו לקבוצות מחקר לפברק ולחקור הידרוג'לים PNP כמו biomaterial. פרוטוקולים אלה מספקים את טכניקות הסינתזה בקנה מידה מעבדה כדי לפברק מספיק חומר הידרוג'ל להמשיך הן במבחנה והן במחקרים vivo. המחקרים שתוארו לעיל מצביעים על כך שהצליבות הדינמיות של חומרים אלה מאפשרות לו להתאים למגוון יישומים ביו-רפואיים על ידי מתן תנועתיות אקטיבית של תאים לכודים תוך הגבלת דיפוזיה פסיבית של מטען מולקולרי. צפוי כי החוקרים ימצאו את פלטפורמת PNP כלי נגיש ורב עוצמה כדי לשפר את התוצאות הקליניות באמצעות אספקת תרופות מבוקרת וללמוד מנגנונים ביולוגיים בסיסיים כגון גיוס תאים mechanobiology.

הידרוג'לים להזרקה הם כלי מתפתח כדי לספק תאים טיפוליים וסמים לגוף בצורה מבוקרת1. חומרים אלה יכולים להיות טעונים עם תרופות או תאים והוא יכול להינתן באופן פולשני מינימלי באמצעות הזרקה ישירה לרקמות שטחיות או על ידי משלוח קטטר לרקמות עמוקות. באופן כללי, הידרוג'לים להזרקה מורכבים מרשתות פולימר נפוחות מים המוצלבות זו לזו על ידי אינטראקציות פיזיות חולפות. במנוחה, crosslinks אלה מספקים מבנה מוצק כמו ג'לים, אבל עם יישום של כוח מכני מספיק crosslinks אלה משובשים באופן זמני, הפיכת החומר למצב דמוי נוזל שיכול בקלות לזרום2. זה אלה תכונות ראולוגיות המאפשרות הידרוג'לים פיזיים לגזירה דק לזרום דרך קטרים מחט קטנה במהלך הזרקה3. לאחר ההזרקה, רשת הפולימר של הרפורמות החומריות, המאפשרת לו לרפא את עצמו וליצור במהירות ג'ל דמוי מוצק במקום4,5. מבנים אלה יכולים לשמש מחסני שחרור איטי עבור תרופות או פיגומים עבורהתחדשות רקמות 6,7. חומרים אלה שימשו ביישומים מגוונים המקיפים טכנולוגיית אספקת תרופות,רפואהרגנרטיבית, אימונו-הנדסה 1,8,9,10,11,12.
הן חומרים טבעיים (למשל, אלגינט וקולגן) והן חומרים סינתטיים (למשל, פולי (אתילן גליקול) (PEG) או פולימרים הידרופיליים דומים) פותחו כחומרי הידרוג'ל להזרקה תואמים ביולוגית13,14,15. חומרים טבעיים רבים מפגינים וריאציה אצווה-לאצווה המשפיעה על הרבייה4,16. חומרים אלה הם לעתים קרובות רגישים לטמפרטורה, ריפוי עם הגעה לטמפרטורות פיזיולוגיות; לפיכך, טיפול בחומרים אלה מציב אתגרים טכניים ולוגיסטיים נוספים17. חומרים סינתטיים מאפשרים בקרה כימית מדויקת יותר ושחזור מעולה, אבל חומרים אלה יכולים לפעמים להיות כפופים לתגובות חיסוניות שליליות המגבילות את תאימותם הביולוגית, תכונה קריטית עבור יישומים טיפוליים vivo6,18,19. מאמצים שנעשו לאחרונה הראו כי ישנם קריטריונים עיצוביים מורכבים רבים המעורבים בהנדסת חומר הידרוג'ל להזרקה, כולל אופטימיזציה של תכונות מכניות, גודל רשת פולימר, רמזים מולקולריים ביו- אקטיביים, מתכלות ואימונוגניות של החומר20,21,22,23,24,25,26. כל הגורמים הללו חייבים להילקח בחשבון בהתאם ליישום של עניין, כלומר פלטפורמה מודולרית, כימית כוונון הוא אידיאלי עבור סיפוק רוחב רחב של יישומים.
השיטות הנוכחיות מתארות את הניסוח ואת השימוש בפלטפורמת הידרוג'ל פולימרית-חלקיקית להזרקה (PNP) המציגה תכונות מכניות ניתנות לכוונון, רמה גבוהה של תאימות ביולוגית ואימונוגניות נמוכה, ומציגה אתרים להטיית רמזים מולקולריים ביו-אקטיביים27,28,29,30,31,32,33. הידרוג'לים PNP אלה מורכבים מפולימרים תאיים שעברו שינוי הידרופובי וננו-חלקיקי קליפת ליבה בהרכבה עצמית הכוללים פולי (אתילן גליקול)-בלוק-פולי (חומצה לקטית) (PEG-PLA)27,34 המקיימים אינטראקציה כדי לייצר רשת סופראמולקולרית. ליתר דיוק, הפולימרים התאיים הידרוקסייפרופילמתיל שעברו שינוי דודציל (HPMC-C12)מקיימים אינטראקציה דינמית עם פני השטח של חלקיקי PEG-PLA ומגשרים בין חלקיקים אלה ליצירת רשת פולימרים זו27,34. אינטראקציות דינמיות ורב-ערכיות אלה מאפשרות לחומרים לגזירה דקה במהלך ההזרקה ולרפא את עצמם במהירות לאחר מתן. רכיבי הידרוג'ל PNP מיוצרים בקלות באמצעות תגובות פשוטות של סיר אחד וההידרוגל PNP נוצר בתנאים מתונים על ידי ערבוב פשוט של שני הרכיבים35. בשל קלות הייצור, פלטפורמת הידרוג'ל זו ניתנת לתרגום בקנה מידה גבוה. התכונות המכאניות וגודל הרשת של הידרוג'ל PNP נשלטים על ידי שינוי אחוז המשקל של רכיבי הפולימר והננו-חלקיקים בניסוח. מחקרים קודמים עם פלטפורמה זו מצביעים על כך שהידרוגלים PNP הם בעלי תאימות ביולוגית, מתכלים ולא אימונוגניים28,30,31. בסך הכל, הידרוג'לים אלה מציגים תועלת רחבה ביישומים ביו-רפואיים המקיפים מניעת הידבקות לאחר הניתוח, הנדסת רקמות והתחדשות, אספקת תרופות מתמשכת ואימונו-הנדסה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

שיטות אלה מתארות כיצד לנסח הידרוג'לים פולימריים-ננו-חלקיקים (PNP) הניתנים להזרקה לשימוש כביו-חומרים. הידרוג'לים PNP מורכבים משני מרכיבים: תאית שונה הידרופובית כמו פולימר הרשת ננו-חלקיקי מעטפת ליבה בהרכבה עצמית הפועלים כמקשרים צולבים שאינם קוולנטיים באמצעות אינטראקציות דינמיות ורב ערכיות. שיטות אלה מתארות הן היווצרות של חלקיקים אלה בהרכבה עצמית באמצעות nanoprecipitation, כמו גם ניסוח וערבוב של שני המרכיבים כדי ליצור הידרוג'לים עם תכונות מכניות מתכווננות. השימוש בפיזור אור דינמי (DLS) וריולוגיה כדי לאפיין את איכות החומרים המסונתזים מפורט גם הוא. לבסוף, התועלת של הידרוג'לים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה ואספקה של תאים מודגמת באמצעות ניסויים במבחנה כדי לאפיין שחרור תרופות, יציבות תרמית, ויישוב תאים וכדאיות. בשל תאימות ביולוגית, הזרקה, ותנאי היווצרות ג'ל מתון, מערכת הידרוג'ל זו היא פלטפורמה מתכווננת בקלות המתאימה למגוון יישומים ביו-רפואיים.

ייצור ואפיון הידרוג'ל PNP הידרוג'לים של PNP נוצרים באמצעות ערבוב של שני המרכיבים העיקריים - פולימרים HPMC שעברו שינוי הידרופובי וננו-חלקיקי PEG-PLA(איור 1a). מטען טיפולי משולב בקלות רבה לתוך החיץ הנוסף המשמש לדלל את רכיב הננו-חלקיקים לפני הכנת הידרוג'ל. לאפיון ביו-רפואי במורד הזרם, נוח להשתמש בשיטת ערבוב מרפקים המאפשרת ערבוב פשוט וניתן לשחזור של שני הרכיבים (איור 1b). לאחר ערבוב הולם, ההידרוגל אמור להרגיש יציב במזרק, אך להיכנע תחת לחץ ולהולל ממחט סטנדרטית (21G מוצגת)(איור 1c). לאחר ההזרקה, ההידרוגל צריך להגדיר במהירות לתוך חומר מוצק כמו המתנגד זרימה מכוח הכבידה. כדי לאפיין באופן מלא את הידרוג'ל ולהבטיח מוצרי אצווה-לאצווה עקביים, יש לנתח דגימות באמצעות מספר ניסויים שונים על מד קנה אופן. ניתן יהיה להבחין בקלות ביכולות ההחלקה והריפוי העצמי של הג'ל באמצעות פרוטוקול סריקת זרימה ופרוטוקול גזירה חורגת, בהתאמה (איור 2a,b). עבור ג'לים נוקשים יותר, כגון ניסוח 2:10, המשתמש צריך לחפש צמיגות כדי להקטין לפחות שני סדרי גודל במהלך לטאטא זרימה כמו קצב הגזירה הוא גדל מ 0.1 ל 100 s-1, אשר מדמה את התנאים המכניים במהלך ההזרקה. פרוטוקול גזירה שלב צריך לחשוף ירידה בסדר גודל צמיגות תחת שלבי גזירה גבוהה, וחזרה מהירה (<5 s זמן התאוששות) לצמיגות בסיסית במהלך שלבי גזירה נמוכים. אפיון מודולי האחסון וההפסד באמצעות ניסוי ניקוי תדר גזירה מתנדנד במשטר הוויסקואלסטי הליניארי אמור לחשוף מאפיינים דמויי מוצק בטווחי תדרים בטווחים שבין 0.1-100 rad s-1 (איור 2c). בפרט, בדרך כלל לא צריך להיות מוצלב של אחסון גזירה ומודולי אובדן כי הוא נצפה בתדרים נמוכים עבור ניסוחים נוקשים כמו הידרוג'לים 2:10. אירוע מוצלב כזה עשוי להצביע על בעיות באיכות החומרים ההתחלתיים, או הפולימר HPMC או PEG-PLA שהשתנה, או הגודל והפיזור של חלקיקי PEG-PLA. יש לציין כי צפוי אירוע קרוסאובר לניסוחים הידרוג'ל חלשים יותר, כגון הידרוג'ל 1:5. מטאטא משרעת גזירה תנודה על הידרוג'לים PNP לחשוף כי החומרים אינם מניבים עד ערכי מתח גבוה מוחלים, המציין חומרים אלה יש מתח תשואה, כמות סף של מתח הנדרש עבור החומר לזרום.
אפיון קינטיקה שחרור מן הידרוג'לים PNP צעד חיוני בעיצוב ג'לים PNP לאספקת תרופות הוא אפיון קינטיקה שחרור סמים מניסוח נבחר. ישנן מספר טכניקות לכך, אך מתודולוגיית במבחנה פשוטה מספקת נתונים שימושיים במהלך פיתוח ניסוח מוקדם (איור 3a). שינוי תכולת הפולימר של הידרוג'ל PNP באמצעות לווסת את כמות HPMC-C12 או NPs היא הדרך הפשוטה ביותר לכוונן את התכונות המכאניות ואת גודל הרשת של הידרוג'לים אלה, אשר יכולה להיות השפעה ישירה על פיזור המטען באמצעות רשת הפולימר וקצב השחרור מהחומרים (איור 3b). עבור מטען גדול יותר מגודל הרשת הדינמי (כלומר, משקל מולקולרי גבוה או רדיוס הידרודינמי גדול), החוקרים צריכים לצפות לשחרור איטי בתיווך פירוק של מטען ממחסן ההידרוגל. ניסוחים עם גדלי רשת דינמיים גדולים או שווים לגודל המטען יאפשרו שחרור בתיווך דיפוזיה שניתן לתאר באמצעות דגמים מסורתיים של דיפוזיה מטען ושחרור46,47,48,49. בהתבסס על הצורה של עקומת השחרור, החוקרים יכולים לעצב מחדש את ההידרוגל כדי לכוון אותו לכיוון איטי יותר (למשל, להגדיל את תכולת הפולימר) או מהר יותר (למשל, להקטין את תוכן הפולימר) שחרור.
הערכת יציבות המטען הטיפולי קביעת היציבות של המטען הטיפולי בניסוח הידרוג'ל היא קריטית לפני תחילת מחקרים פרה-קוליניים או תאיים. בהשוואה לשיטות סינתטיות אחרות לאנקפסולציה של תרופות, הידרוג'לים של PNP משלבים מטען בצורה עדינה על ידי ערבוב לתוך החומר בתפזורת, ולא סביר כי אנקפסולציה תפגע במטען. מחקרים אלה מצביעים על כך שהידרוג'ל PNP יכול גם לייצב מטען הרגיש לחוסר יציבות תרמית, כגון אינסולין, הארכת חיי מדף משמעותית והפחתת ההסתמכות על אחסון והפצה של קרים (איור 4). חשוב להעריך את מצב המטען מיד לאחר אנקפסולציה לתוך הידרוג'ל, כמו גם לאחר תקופות ממושכות של אחסון. נתונים אלה מראים כי האינסולין נשאר יציב הידרוג'ל לאחר 28 ימים של אחסון תחת מתח תרמי ומכאני מתמשך, באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות פשוטה למדידת צבירת אינסולין. טכניקה חלופית במקרים שבהם בדיקה מתאימה של צלחת אינה זמינה תהיה לבצע מדידות דיכרואיזם מעגליות של המטען, אשר שימושי במיוחד לקביעת המבנה המשני של תרופות חלבון.
קביעת הכדאיות והפיזור של התאים בהידרוגלים של PNP תאים טיפוליים רבים דורשים מוטיבים הידבקות להישאר קיימא, ובכך הכללה של מוטיבים integrin כמו ארגינין-גליצין אספרטידים (RGD) פפטידים הוא צעד חשוב בהתאמת הידרוג'לים PNP לטיפולים הסלולר50. PEG מודולרי-PLA פולימר המרכיבים את NPs מאפשר תפקוד כימי של קורונה PEG באמצעות פשוט "לחץ" כימאים28,51. בדוגמה זו, פפטידים RGD דבק תאים היו מחוברים פולימר PEG-PLA כדי לקדם את מעורבות התא עם מבנה הידרוג'ל PNP. ניסוחים חסרים אתרי הידבקות יהיו בעלי כדאיות נמוכה לתאים, שכן תאים שעברו אנקפסולציה אינם מתרבים בהשוואה לתאים עטופים בניסוחים עם מוטיבים אלה של הידבקות (איור 5a, b). תאים שעברו אנקפסולציה יכולים להיות מסומנים בקלסין AM או בצבע פלואורסצנטי מתאים אחר (למשל, CFSE) כדי להקל על ספירת תאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. במהלך אופטימיזציה, יש להשוות את הכדאיות להידרוגלים PNP ללא שינוי כדי להבטיח ניסוחים פונקציונליים integrin מספקים כדאיות משופרת והתפשטות. אם ניסוחים פונקציונליים integrin מספקים יעילות דומה הידרוג'לים ללא שינוי, זה עשוי להצביע על כשל בכימיה ההטיה המשמשת לשלב את מוטיבים הידבקות.
החוקרים צריכים לצפות תאים encapsulated להיות מפוזרים באופן שווה דרך מדיום הידרוג'ל בעת שימוש ניסוח הידרוג'ל מתאים. זה יאפשר מינון עקבי וצפוי של תאים במהלך ניהול הידרוג'ל צריך לתרגם שימור מקומי של תאים הידרוג'ל לאחר הממשל. ניתן לקבוע בקלות את התפלגות התאים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות. תאים יכולים להיות מסומנים בצבע מתאים ולאחר מכן תמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ניתן להעריך את התמונות באופן חזותי (איור 5c) וגם באופן כמותי (איור 5d) באמצעות תוכנת ImageJ למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאורך הציר האנכי של התמונה (או לאורך הציר שיקומי עקב כוח המשיכה). אם ניסוח ההידרוגל חלש מכדי לתמוך בתאים בהשעיה לאורך פרקי זמן ממושכים, תתרחש התיישבות תאים, כפי שנצפה בניסוח 1:1 באיור 5. הגדלת תכולת הפולימר יכולה לפתור בעיות בפיזור תאים לא הומוגני עקב התיישבות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> איור 1: הידרוג'לים פולימריים-ננו-חלקיקיים (PNP) נוצרים בקלות על-ידי ערבוב שני רכיבים. (א) המרכיב הראשון הוא פתרון של תאית הידרוקסיפרופילמתיל (HPMC-C12)שעברו שינוי דודציל , והמרכיב השני הוא פתרון של חלקיקי פולי (אתילן גליקול)-בלוק-פולי (חומצה לקטית) (PEG-PLA) חלקיקים יחד עם כל מטען טיפולי. ערבוב עדין של שני רכיבים אלה מניב הידרוג'ל להזרקה, שבו הפולימרים HPMC-C12 מקושרים פיזית על ידי אינטראקציות דינמיות ורב ערכיות עם חלקיקי PEG-PLA. (ב)צילום הוכחת ניסוח ג'ל על ידי ערבוב עם שני מזרקים, כל אחד מכיל מרכיב אחד של הידרוג'ל PNP. על ידי חיבור שני המזרקים עם מחבר מרפק מנעול Luer, ניתן לערבב בקלות את שני הרכיבים בתנאים סטריליים כדי להניב הידרוג'ל ללא בועה טעון מראש לתוך מזרק לשימוש מיידי. פתרון NP צבוע בכחול לצורך הדגמה. (ג)הדגמה של הזרקת הידרוג'לים PNP והתמצקותם מחדש. (i) הידרוג'ל PNP במזרק עם מחט 21G מחובר. (ii) ההזרקה ממקמת את ההידרוגל תחת גזירה אשר שוברת זמנית את האינטראקציות בין פולימר לננו-חלקיקים, ויוצרת עקביות דמוית נוזל. (iii) לאחר ההזרקה, אינטראקציות פולימר-חלקיקים דינמיות במהירות רפורמה, המאפשר הידרוג'ל לרפא את עצמו לתוך מוצק. (iv) הידרוג'ל מוצק אינו זורם תחת כוחות חלשים יותר מאשר מתח התשואה שלה, כגון כוח הכבידה. הידרוג'ל PNP צבוע כחול לצורך הפגנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> איור 2: אפיון ראולוגי של שתי ניסוחים הידרוג'ל PNP. ניסוחים מסומנים כפולימר wt.%: NP wt.%. (א) זרימת גזירהיציבהגורפת משיעור גזירה נמוך עד גבוה של הידרוג'לים PNP. צמיגות כפונקציה של קצב גזירה מאפיינת תכונות דלילות גזירה. (ב)צמיגות כפונקציה של שיעורי גזירה מתנדנדים בין שיעורי גזירה נמוכים (רקע לבן; 0.1 s-1)לשיעורי גזירה גבוהים (רקע אדום; 10 s-1) המדגימים תכונות ריפוי עצמי של הידרוג'לים PNP. שיעורי גזירה מוטלים על 30 שניות כל אחד. (ג)מודולוס אחסון אלסטי G′ ומודולוס הפסד צמיג G" כפונקציה של תדירות ב 1% זן קבוע עבור ניסוחים שונים הידרוג'ל PNP. (ד)משרעת מטאטא בתדירות קבועה של 10 rad/s כדי לאפיין מודולוס אחסון אלסטי G′ ו modulus Gאובדן צמיג " של הידרוג'לים PNP כפונקציה של מתח. אפיון ראולוגי זה יכול לשמש כהשוואה לבקרת איכות. נתון זה הותאם מ- Grosskopf ואח '28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> איור 3: אין ויטרו שחרור של אלבומין סרום שור (BSA) מ PNP הידרוג'לים. ניסוחים מסומנים כפולימר wt.%: NP wt.%. (א)סכמטי המתאר את פרוטוקול שחרור במבחנה הניסיוני. Aliquots מוסרים מצינורות נימי הידרוג'ל PNP טעון לאורך זמן. (ב)המהדורה במבחנה של BSA מ 1:10 PNP, 2:5 PNP ו 2:10 PNP דיווחו כמו המסה שנאסף על ידי נקודת הזמן שצוינה מחולק על ידי המסה הכוללת שנאספה במהלך assay (נתונים המוצגים כ ממוצע ± SD; n = 3). BSA זוהה באמצעות מדידות ספיגה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> איור 4: יציבות תרמית של אינסולין עטוף הידרוג'ל PNP על ידי ThT assay. ניסוחים מסומנים כפולימר wt.%: NP wt.%. אינסולין עטוף הן 1:5 ו 2:10 PNP הידרוג'ל נשאר ללא הפרדה במשך 28 ימים בתנאי הזדקנות הדגיש של 37 °C (69 °F) ותסיסה מתמדת. זמן צבירת אינסולין מנוסח PBS היה 20 ± 4 שעות (ממוצע ± SD, סף צבירה 750,000 AFU). נתונים המוצגים כממוצע של n = 4 משכפלים ניסיוניים (AFU, יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות). נתון זה הותאם מ- Meis et al.38<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> איור 5: כדאיות התא והתיישבות התאים בהידרוגלים של PNP. (a,b) מחקרי כדאיות תאים בהידרוגלים PNP עם תאי גזע מסנצ'מיליים אנושיים (hMSCs). (א)תמונות מייצגות של hMSCs קיימא ב 1:5 הידרוג'לים PNP עם ובלי תא דבק ארגינין-גליצין-אספרטי (RGD) מוטיב מצומדים PEG-PLA NPs. hMSCs היו מוכתמים קלצין במשך 30 דקות לפני הדמיה confocal. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (b) הכדאיות של התא ביום 6 מוגדרת כמספר תאים פלואורסצנטיים בתמונה יחסית למספר התאים הפלואורסצנטיים ביום 1 (נתונים המוצגים כ ממוצעים ± SD; n = 3). (ג,ד) אנקפסולציה של תאים וניסויי יישוב עם רכיבי HMSC. (ג) תמונות בעוצמה מרבית של רכיבי HMSCs מוכתמים ב- 1:1 PNP (שורה עליונה) ו- 1:5 PNP הידרוג'ל (שורה תחתונה) לרוחב 4 שעות לכימות שקיעת התאים. סרגל שינוי קנה המידה מייצג 1 מ"מ.(ד)עוצמת הפיקסל האופקי הממוצעת של רכיבי hMSCs לאורך הפרופיל האנכי של ההידרוגל. נתון זה הותאם מ- Grosskopf ואח '28<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והניסוח של ביו-חומרים הידרוג'ל הידרוג'ל להזרקה, סופראמולקולריים (PNP). יישומים של חומרים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה של תאים ואספקה מודגמים.

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר ניסוח של הידרוג'ל פולימר-חלקיקי לשימוש כמו ביו-חומרים. אנו מקווים שהחוקרים יפתחו חומר זה עבור יישומים תרגומיים ולחקור שאלות ביולוגיות בסיסיות. הידרוג'לים PNP מוזרקים בקלות דרך מחטים קטנים קוטר קטטרים, אבל מהר לרפא את עצמו לאחר הזרקה.זה מאפשר משלוח מבוקר לא פולשני של תרופות ותאים לאורך צירי זמן ארוכים. טכנולוגיה זו דוחפת את הגבולות לטיפול מקומי ושחרור תרופות מורחב, עם השלכות על מצבים משתוללים רחבים מסרטן להתחדשות רקמות לחיסון פסיבי. כדי לסנתז ננו-חלקיקים על ידי משקעים ננו, להוסיף 50 מיליגרם של פולימר PEG-PLA בקבוקון זכוכית שמונה מיליליטר נוצץ ולהוסיף מיליליטר אחד של אצטוניטריל לבקבוקון.וורטקס להתמוסס לחלוטין. לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של מים טהורים במיוחד בקבוקון זכוכית 20 מיליליטר עם בר ערבוב קטן ומניחים את הבקבוקון על צלחת ערבוב להגדיר 600 סיבובים לדקה. השתמש פיפטה 200 microliter להוסיף מיליליטר אחד של פתרון ממס פולימר dropwise לבקבוקון של מים.חלקיקי ליבה-פגז ייווצרו כמו פתרון ממס פולימר מפוזר במהירות בכל המים. אמת את גודל החלקיקים על-ידי פיזור אור דינאמי בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן העבירו את פתרון הננו-חלקיקים ליחידת סינון צנטריפוגלית כדי לרכז את הפתרון לפחות מ-250 מיקרוליטרים ולחדש את הננו-חלקיקים במאגר מתאים.כדי להכין את הידרוג'ל, להוסיף 333 מיליגרם של 6%HPMC-C12 פתרון מנייתי מזרק מנעול לואר מיליליטר אחד ולהוסיף 500 מיקרוליטר של פתרון 20% ננו חלקיקים ו 167 microliters של PBS בקבוקון שמונה מיליליטר. לאחר ערבוב, להשתמש במחט כדי למלא עוד מזרק מנעול לואר מיליליטר אחד עם פתרון ננו חלקיקים מדולל ולחבר את שני המזרקים מערבל מרפק. מערבבים את שני הפתרונות כ-60 מחזורים עד שנוצר חומר הידרוג'ל לבן הומוגני ואטום.כדי למדוד את המאפיינים הריאולוגיים של הידרוג'ל מנוסח, להזריק את הנפח המתאים של הידרוג'ל על פי הפער הגיאומטרי שנבחר למרכז צלחת rheometer משונן ולהשתמש בבדיקות תנודה וזרימה כדי למדוד את המאפיינים המכאניים של המדגם. כדי לאפיין את שחרור התרופה מן הידרוג'ל, הראשון, להכין נימי זכוכית באמצעות אפוקסי לאטום קצה אחד של כל צינור. כאשר האפוקסי מוגדר, להשתמש במחט hypodermic 22 אינץ' 4 אינץ' להזריק 100 כדי 200 microliters של הידרוג'ל לתוך מינימום של שלושה צינורות לכל מדגם, בזהירות להוסיף 200 כדי 300 מיקרוליטרים של PBS על כל נפח של הידרוג'ל.בנקודות הזמן המתאימות, על פי ציר הזמן הצפוי של שחרור סמים, להשתמש במחט כדי להסיר בזהירות את PBS מכל נימי מבלי להפריע משטח הידרוג'ל ולהוסיף נפח טרי של PBS. בסיום המחקר, לנתח את aliquots PBS שנאספו עם שיטה מתאימה לכמת את כמות התרופה שוחרר בכל נקודת זמן. כדי לאפיין את היציבות התרמית של אינסולין אנקפסולציה ג'ל, לטעון הן אינסולין thioflavin T לתוך הידרוג'ל כפי שהוכח ולהשתמש מחט 21 מד להזריק 200 microliters של המטען ולבדוק הידרוג'ל טעון לתוך לפחות שלוש בארות של צלחת שחורה 96-באר לכל מדגם.לאחר מכן לאטום את הצלחת עם חותם צלחת דבק אופטי ברור כדי למנוע אידוי ולהכניס את הצלחת לתוך קורא צלחת מצויד בקרת טמפרטורה, רועד תכנות קריאה קינטית. כדי להעריך את הכדאיות התא אנקפסולציה הידרוג'ל, להשתמש במחט 21 מד להזריק 150 microliters של הידרוג'ל המכיל את הריכוז המתאים של תאים לתוך כל אחת משלוש בארות לכל מדגם בצלחת 96-well התחתון ברור ולהוסיף 100 microliters של מדיום התא המתאים לתוך כל נפח של הידרוג'ל. ביום הראשון של התרבות, להחליף את supernatant על כל הידרוג'ל בנקודת הזמן המתאימה עבור כל קבוצת מדגם עם 50 microliters של פתרון AM קלצין שני מילימולאר.לאחר דגירה של 30 דקות, תמונה במרכז כל באר על ידי מיקרוסקופיה confocal. כדי להעריך את היכולת של התאים encapsulated להתיישב במזרק לפני ההזרקה, לדלל את התאים של עניין אחד פעמים 10 כדי שישה תאים למיליליטר בריכוז PBS ולהכתים את התאים עם 50 microliters של שני קלצין מילימולר AM במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מערבבים את התאים עם 500 עד 700 מיקרוליטרים של הידרוג'ל כפי שהוכח ומשתמשים במחט 21 מד להזריק 100 עד 200 מיקרוליטרים של תא המכיל הידרוג'ל לתחתית של לפחות cuvette אחד לכל מדגם.ואז לדמיין את cuvettes שוכב שטוח על הצדדים שלהם על הבמה של מיקרוסקופ confocal מיד לאחר ההזרקה ובשעה וארבע שעות לאחר הזריעה כדי לבחון אם התאים התיישבו הידרוג'ל או אם הם נשארו מושעים. ניתן להבחין ביכולות ההידלדלות והריפוי העצמי של הג'ל באמצעות סריקת זרימה ופרוטוקולי גזירה חורגת, בהתאמה. אפיון מודולי אחסון ואובדן באמצעות ניסוי ניקוי תדר גזירה תנודה במשטר viscoelastic ליניארי בטווחי תדירות בין 0.1 ל 100 radians לשנייה חושף את המאפיינים דמויי מוצק.בדרך כלל לא צריך להיות מוצלב של אחסון גזירה ומודולי אובדן שנצפו בתדרים נמוכים עבור ניסוחים נוקשים יותר, בעוד אירועי קרוסאובר ניתן לצפות ניסוחים הידרוג'ל חלש. שינוי תכולת הפולימר של הידרוג'ל PNP יכול להיות בעל השפעה ישירה על פיזור המטען באמצעות רשת הפולימר וקצב השחרור מהחומרים. הידרוג'לים של PNP יכולים גם לייצב מטען הרגיש לחוסר יציבות תרמית, להאריך במידה ניכרת את חיי מדף המטען ולצמצם את ההסתמכות על אחסון והפצה של שרשרת קרה.הכללת מוטיבים של אינטגרין יכולה להיות שימושית להתאמת הידרוג'לים PNP לטיפולים תאיים. תאים שעברו אנקפסולציה יכולים להיות מסומנים בפלורסנטיות כדי להקל על ההדמיה והכימות שלהם. לדוגמה, ניסוחים חסרים אתרי הידבקות יהיה כדאיות תא נמוך כמו תאים encapsulated להיכשל להתרבות לעומת תאים encapsulated וניסוחים עם מוטיבים הידבקות, כגון RGD.אנו עדיין בוחנים כיצד שינויים בניסוח משפיעים על המאפיינים הריאולוגיים והרשת הדינמית של מטריצת הפולימרים. אנו משתמשים גם FRAP כדי ללמוד את הדיפוזיה של מולקולות בתוך הידרוג'ל. חומרים אלה יכולים לשמש כדי לשאול שאלות ביולוגיות חדשות על איך משלוח מתמשך עשוי להשפיע על אספקת תרופות, פיתוח חיסון או אימונותרפיה של סרטן.

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

Abstract