Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Sinirbilim Görüntüleme Servisi'ne bu proje için ekipman ve alan sağladığı için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Stanford Kanser Enstitüsü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü Stanford'un intramural finansmanının yanı sıra Macaristan Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi'nden GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 tarafından desteklenmiştir.

1. Plazmid yapımı
<ol><li>eGFP-mCherry1 füzyon probunu oluşturmak için, AgeI ve BsrGI kısıtlama bölgeleri kullanılarak eklenen mCherry1 10 ile bir N1 memeli hücre ekspresyon vektörü (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.</li>
	<li>SalI-BamHI parçası olarak bir durdurma kodonu olmadan eGFP11'i yükseltmek için aşağıdaki oligonükleotidleri kullanın: N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G ...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Sunulan protokol, alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunun tespitini ve donör molekülün konfokal mikroskopi ile söndürülmesini kullanarak FRET'yi ölçmek için genetik olarak eşleşmiş bire bir floresan protein kalibrasyon probunun kullanımını detaylandırmaktadır. Bu yöntem, farklı hücre altı bölmelerde canlı hücrenin fizyolojik bağlamındaki protein etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir. Uzamsal çözünürlük, bir görüntünün her pikselindeki FRET verimliliklerini hesapl...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Rezonans Enerji Transferi'nin (FRET) mikroskopi tabanlı analizi, canlı hücrelerdeki proteinler arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesine izin verir. Etkileşimin hücrenin neresinde ve hangi hücre altı bölmede gerçekleştiği ve bu etkileşimin zaman içinde değişip değişmediği hakkında bilgi de dahil olmak üzere mekansal ve zamansal bilgi sağlar.
Theodor Förster, 1948'de FRET'in teorik temelini attı1. FRET, uyarılmış bir donörden bir alıcı moleküle radyasyonsuz bir enerji transferidir ve moleküllerin mesafesine ve geçiş dipollerinin göreceli oryantasyonuna ve ayrıca donör emisyonu ile alıcı absorpsiyon spektrumları arasındaki örtüşmeye bağlıdır. Enerji transfer hızı, donör-alıcı mesafesinin altıncı gücü ile ters orantılıdır. Böylece, FRET 1-10 nm aralığında moleküler yakınlığı ölçmek için kullanılabilir.
FRET, donör molekülün diğer uyarım giderme işlemleriyle rekabet eder ve alıcının donör söndürme ve hassaslaştırılmış emisyonu ile sonuçlanır. Donör söndürme, yayılan donör fotonlarının sayısının azaltılmasıdır, hassaslaştırılmış emisyon ise yayılan alıcı fotonlarda bir artıştır. Birçok mikroskobik FRET analizi, alıcı fotobeyazlatma 2, donör fotobeyazlatma2 veya alıcı3'ün FRET-duyarlılaştırılmış fotobeyazlatma dahil olmak üzere floresan yoğunluğu ölçümlerini kullanır.
Burada, genellikle oranmetrik FRET olarak adlandırılan bir yöntem olan donör söndürme ve alıcı duyarlılaştırılmış emisyon 4,5 kullanarak FRET'yi ölçmek için adım adım deneysel bir protokol ve matematiksel algoritma sunulmaktadır. Hassaslaştırılmış emisyonun nasıl yaklaşacağına dair birçok protokol yayınlanmıştır, çok azı mutlak FRET verimliliğiniölçmüştür 6,7,8,9. Canlı hücredeki FRET verimliliklerinin nicelleştirilmesi, (i) floresan proteinlerin çapraz konuşmasının (spektral dökülme veya kanama) ve ayrıca (ii) mikroskobik kurulumun tespit verimliliğinin belirlenmesini gerektirir. Çapraz konuşma, floroforlardan sadece birini eksprese eden görüntüleme hücreleri ile değerlendirilebilirken, donör ve alıcı floresansının göreceli tespit etkinliğinin değerlendirilmesi daha karmaşıktır. En azından ölçülen sinyallere yol açan donör ve alıcı molekül sayısının oranının bilinmesini gerektirir. Bununla birlikte, canlı hücrelerde eksprese edilen floroforların sayısı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Sözde α faktörü, tek bir uyarılmış donör ve alıcı molekülden gelen göreceli sinyal güçlerini karakterize eder. Faktör bilgisi, floresan proteinlerle canlı hücre görüntülemesi sırasında karşılaşılan değişken alıcı-donör molekül oranlarına sahip örneklerde kantitatif oranmetrik FRET ölçümleri için bir ön koşuldur. Kalibrasyon probu olarak 1'e 1 donör-alıcı füzyon proteini kullanmak, α faktörünün belirlenmesine izin verir ve ayrıca pozitif bir kontrol görevi görür. Bu genetik olarak bağlanmış prob, hücreler tarafından bilinmeyen toplam miktarlarda, ancak bire bir sabit ve bilinen göreceli bir miktarda eksprese edilir. Aşağıdaki protokol, 1'e 1 probun nasıl oluşturulacağını ve FRET verimliliğinin ölçülmesi için nasıl kullanılacağını ortaya koymaktadır. Tüm formülleri içeren bir elektronik tablo ekte bulunabilir ve okuyucular tarafından aşağıda belirtildiği gibi ilgili sütunlara kendi ölçümlerini girmek için kullanılabilir.
Protokol GFP-Cherry donör / alıcı çiftini kullanırken, sunulan yaklaşım başka herhangi bir FRET çifti ile gerçekleştirilebilir. Ek Dosya 1, camgöbeği-sarı çiftleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), uyarılmış bir donörden bir alıcı moleküle radyasyonsuz enerji transferidir ve moleküllerin mesafesine ve oryantasyonuna ve ayrıca donör emisyonu ile alıcı absorpsiyon spektrumları arasındaki örtüşme derecesine bağlıdır. FRET, canlı hücredeki proteinlerin zaman içinde ve farklı hücre altı bölmelerdeki etkileşimini incelemeye izin verir. Literatürde mikroskopi kullanarak FRET ölçümü için farklı yoğunluk tabanlı algoritmalar tanımlanmıştır. Burada, hem alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu hem de donör molekülün söndürülmesini ölçmeye dayanarak FRET verimliliğini ölçmek için bir protokol ve bir algoritma sağlanmaktadır. Canlı hücredeki oranmetrik FRET'nin nicelleştirilmesi, sadece floresan proteinlerinin çapraz konuşmasının (spektral dökülme veya kanama) belirlenmesini değil, aynı zamanda mikroskobik kurulumun tespit verimliliğini de gerektirir. Burada sağlanan protokol, bu kritik parametrelerin nasıl değerlendirileceğini ayrıntılarıyla açıklamaktadır.

Şekil 1, sırasıyla donör kanal, kanal 1 (488, 505-530 nm), transfer kanalı, kanal 2 (488, >585 nm) ve alıcı kanal, kanal 3'te (561, >585 nm) elde edilen görüntüleri göstermektedir. Sadece GFP'yi, sadece Cherry'yi, GFP ve Cherry'yi birlikte eksprese eden ve GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden hücrelerin temsili görüntüleri. GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden NRK hücrelerinde (pozitif kontrol, Şekil 2A) ve GFP-Cherry'yi (negati...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Bu protokol, donör söndürme ve alıcı duyarlılaştırılmış emisyon kullanarak FRET'yi ölçmek için adım adım deneysel bir süreç ve matematiksel algoritmayı açıklar. Canlı hücredeki FRET verimliliklerinin miktarının belirlenmesi, floresan proteinlerinin çapraz etkileşiminin ve mikroskobik kurulumdaki floroforların göreceli emisyon ve algılama verimliliklerinin belirlenmesini gerektirir. Crosstalk, sadece bir florofor eksprese eden görüntüleme hücreleri ile değerlendirilebilir.Bir donörün veya bir alıcı molekülün tespit verimliliğinin değerlendirilmesi, ölçüm sinyaline yol açan donör ve alıcı moleküllerin sayısının oranının bilinmesini gerektirir. Canlı hücrelerde eksprese edilen floroforların sayısı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Bu yöntemde kullanılan kalibrasyon probu, bire bir donör-alıcı füzyon proteini, donör ve alıcı moleküllerin göreceli tespit verimliliğini belirlemeyi mümkün kılar.Başlamak için, EGFP mCherry 1 füzyon probunu üretmek için mCherry 1 ile bir N1 memeli hücre ekspresyon vektörü kullanın. Bir hücre bir BAM h1 parçası olarak bir durdurma kodonu olmadan EGFP'yi yükseltmek için oligonükleotidler tasarlayın. Yeşil ve kırmızı floresan protein arasındaki beş amino asit bağlayıcısı, GFP kiraz donör-alıcı çifti için 0.25 ila 0.3 arasında ortalama bir FRET eksikliği vermelidir.Arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı olmadan herhangi bir hücre çizgisi ve ortam kullanın. Hücreler% 80 birleştiğinde, bunları bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile ayırın ve beş mililitrelik bir hücre süspansiyonundan üç damla ekleyerek sekiz delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yaklaşık 10.000 hücre tohumlayın. Kaplamadan 24 saat sonra, uygun bir transfeksiyon ortamı kullanarak hücreleri transfekte edin.Uygun floresan protein ekspresyonuna, katlanmaya ve olgunlaşmaya izin vermek için canlı hücre görüntülemeden önce hücreleri 20 saat boyunca inkübe edin. Nemlendirilmiş ve ısıtılmış bir çevre odasındaki hücreleri, konfokal tarama mikroskobu ile 37 santigrat derecede görüntüleyin. Hücre ortamını fizyolojik pH'ta tamponlamak için, hücre ortamını karbondioksitten bağımsız hale getirmek için 20 milimolar HEPES ekleyin.Ardından slaytı mikroskopa monte edin. GFP'yi heyecanlandırmak için argon iyon lazerinin 488 nanometre çizgisini ve kirazı heyecanlandırmak için 561 nanometre diyot lazerini kullanın. 488 nanometre lazeri, 505 ila 530 nanometrelik bir emisyon bandı aracılığıyla birinci kanalda ve 585 nanometrenin üzerinde uzun geçiş filtresiyle ikinci kanalda uyarma için ayarlayın.585 nanometrenin üzerinde uzun geçiş filtresiyle üçüncü kanalda uyarma için 561 nanometre lazeri kullanın. İki lazeri sırayla uyarın ve görüntüleme modunu her satırdan sonra değişecek şekilde ayarlayın, böylece 512 x 512 piksel görüntünün uyarılması her satırdan sonra değişir. Önemli fotobeyazlatma meydana gelip gelmediğini tespit etmek ve gerekirse lazer gücünü azaltmak için üç görüntüden oluşan mini bir zaman serisi ayarlayın.İlk olarak, GFP kiraz füzyon yapısını ifade eden görüntü hücreleri. Konfokal görüntüde piksel başına zamana entegre lazer yoğunluğunu tanımlayan parametreleri ayarlayın. 63X yağ hedefi kullanın ve bir hücreyi tamamını yeterli büyütme ve çözünürlükle görüntülemek için 3X'e ayarlayın.70 ila 80 nanometrelik bir piksel boyutunu hedefleyin. Piksel bekleme süresini iki ila dört mikrosaniyeye ve 488 nanometre ve 561 nanometre lazer için AOTF iletimine ayarlayın, böylece görüntüler herhangi bir ağartma olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı gösterir ve floresan yoğunluğu doygunluğunu gösteren piksel yoktur. 488 ve 561'in lazer gücünü, birinci ve üçüncü kanaldaki sinyal seviyeleri benzer olacak şekilde ayarlayın.Fotoğraf çarpanı kazancını 600 ila 800 olarak ayarlayın. Resim 15 ila 20 GFP kiraz füzyon proteinini eksprese eden hücreler, GFP, kiraz, GFP ve kirazı eksprese eden hücreler ve transekte olmayan hücreler. Daha sonra, ilgilenilen proteinleri birlikte ifade eden görüntü hücreleri, sırasıyla GFP ve kiraz ile birleşti.FRET'i hesaplamak için, birinci kanaldaki donör sinyalini, 488 nanometre uyarımlı donör kanalını ve 505 ila 530 nanometrelik bir emisyon bandını ölçün. Daha sonra alıcı sinyalini üçüncü kanalda, alıcı kanalda 561 nanometre uyarım ve 585 nanometrenin üzerinde emisyon ile ölçün. Son olarak, FRET sinyalini ikinci kanalda, 488 nanometre uyarım ve 585 nanometrenin üzerinde emisyon ile transfer kanalında ölçün.İkinci kanaldaki sinyal dört farklı bileşenin toplamıdır: söndürülmüş donör sinyalinden çapraz konuşma faktörü S1 ile 585'in üzerindeki algılama kanalına spektral yayılma, çapraz konuşma faktörü S2 ile 488 nanometre ışık tarafından doğrudan uyarılmadan gelen alıcı sinyal, alıcının FRET tarafından uyarılmış donör molekülünden duyarlılaştırılmış emisyonu, ve arka plan sinyali. Donör kanalında, transfer kanalında ve alıcı kanalda, sadece GFP'yi eksprese eden hücrelerde, sadece kirazda, GFP ve kirazı birlikte eksprese eden hücrelerde ve GFP kiraz füzyon proteininde görüntüler elde edildi. GFP kiraz füzyon proteinini eksprese eden NRK hücrelerinde ve GFP kirazını birlikte eksprese edenlerde hesaplanan ortalama hücresel FRET verimlilikleri, her hücredeki alıcı-donör oranı yoğunluk oranı veya moleküler orana göre çizilmiştir.GFP kiraz füzyon proteinini ifade eden, GFP ve kirazı negatif bir kontrol olarak birlikte ifade eden ve Ashwell-Morell reseptörünün reseptör alt birimlerini ifade eden hücrelerin normalleştirilmiş piksel piksel FRET görüntüleri burada gösterilmiştir. Sıçan hepatik lektininin RHL1 ve 2'si, plazma zarının sitoplazmik tarafında GFP ve kiraz ile etiketlendi. GFP RHL1 ve kiraz RHL2 ve GFP RHL1 delta stoğu ve kiraz RHL2'yi eksprese eden hücrelerin ortalama hücresel FRET verimlilikleri, alıcı-donör moleküler oranına göre çizilmiştir.Sunulan nicel FRET yaklaşımı aşağıdakilere izin verir. Canlı hücrenin fizyolojik bağlamında protein etkileşimlerinin tespiti. Protein etkileşimlerinde zamanla meydana gelen değişiklikler.Hücre altı bölmelerdeki etkileşimlerde, konfokal görüntünün piksel düzeyine göre piksele kadar olan etkileşimlerdeki farklılıklar. Ve tespit edilen FRET sinyalinin canlı bir hücrede ifade edilen moleküler alıcı-donör oranına bağımlılığı.