نود أن نشكر خدمة تصوير علم الأعصاب في كلية الطب بجامعة ستانفورد على توفير المعدات والمساحة لهذا المشروع. تم دعم هذا البحث من خلال التمويل الداخلي لمعهد ستانفورد للسرطان وقسم الأورام النسائية في ستانفورد بالإضافة إلى GINOP-2.3.2-15-2016-00026 و GINOP-2.3.3-15-2016-00030 و NN129371 و ANN135107 من المكتب الوطني للبحث والتطوير والابتكار ، المجر.

1. بناء البلازميد
<ol><li>لتوليد مسبار الانصهار eGFP-mCherry1 ، استخدم متجه تعبير خلية الثدييات N1 (انظر جدول المواد) مع إدخال mCherry110 باستخدام مواقع التقييد AgeI و BsrGI.</li>
	<li>استخدم قليل النيوكليوتيدات التالية لتضخيم eGFP11 بدون كودون توقف كجزء من SalI-BamHI : ا?...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

يفصل البروتوكول المقدم استخدام مسبار معايرة البروتين الفلوري المقترن وراثيا من واحد إلى واحد لقياس FRET باستخدام الكشف عن الانبعاث الحساس لمستقبل وتبريد جزيء المتبرع بواسطة المجهر متحد البؤر. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتقييم تفاعلات البروتين في السياق الفسيولوجي للخلية الحية في مقصورات تحت...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

يسمح التحليل المجهري لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) بتقييم التفاعلات بين البروتينات في الخلايا الحية. يوفر معلومات مكانية وزمانية ، بما في ذلك معلومات حول مكان حدوث التفاعل في الخلية وفي أي مقصورة تحت خلوية وما إذا كان هذا التفاعل يتغير بمرور الوقت.
وضع ثيودور فورستر الأساس النظري ل FRET في عام 19481. FRET هو نقل للطاقة بدون إشعاع من متبرع متحمس إلى جزيء متقبل ويعتمد على مسافة الجزيئات والاتجاه النسبي لثنائيات أقطاب انتقالها بالإضافة إلى التداخل بين انبعاث المانحين وأطياف امتصاص المستقبل. يتناسب معدل نقل الطاقة عكسيا مع القوة السادسة لمسافة المتبرع والمستقبل. وبالتالي ، يمكن استخدام FRET لقياس القرب الجزيئي في حدود 1-10 نانومتر.
يتنافس FRET مع عمليات إزالة الإثارة الأخرى لجزيء المتبرع وينتج عنه ما يسمى بتبريد المانحين وانبعاث التحسس للمتقبل. تبريد المانحين هو تقليل عدد الفوتونات المانحة المنبعثة ، في حين أن الانبعاث الحساس هو زيادة في الفوتونات المستقبلة المنبعثة. تستخدم العديد من تحليلات FRET المجهرية قياسات شدة التألق ، بما في ذلك التبييض الضوئي المتقبل 2 ، أو التبييض الضوئي للمانح2 ، أو التبييض الضوئي الحساس بالحنق للمتقبل3.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي خطوة بخطوة وخوارزمية رياضية لتحديد FRET باستخدام تبريد المانحين والانبعاث المتقبل 4,5 ، وهي طريقة يشار إليها غالبا باسم FRET النسبي. تم نشر العديد من البروتوكولات حول كيفية تقريب الانبعاثات الحساسة ، وقليل منها حدد كفاءة FRET المطلقة6،7،8،9. يتطلب القياس الكمي لكفاءات FRET في الخلية الحية تحديد (i) الحديث المتبادل (الانسكاب الطيفي ، أو النزيف) للبروتينات الفلورية ، وكذلك (ii) كفاءة الكشف عن الإعداد المجهري. في حين يمكن تقييم الحديث المتبادل عن طريق تصوير الخلايا التي تعبر عن واحد فقط من الفلوروفورات ، فإن تقييم كفاءة الكشف النسبية لتألق المتبرع والمستقبل أكثر تعقيدا. يتطلب معرفة نسبة عدد جزيئات المانحين والمستقبلين على الأقل التي تؤدي إلى الإشارات المقاسة. ومع ذلك ، يختلف عدد الفلوروفورات المعبر عنها في الخلايا الحية من خلية إلى أخرى وهو غير معروف. يميز ما يسمى بعامل α قوة الإشارة النسبية من جزيء مانح ومتقبل واحد متحمس. تعد معرفة العامل شرطا أساسيا لقياسات FRET التناسبية الكمية في العينات ذات نسب جزيء المستقبل إلى المتبرع المتغيرة كما تمت مواجهتها أثناء تصوير الخلايا الحية باستخدام البروتينات الفلورية. يسمح استخدام بروتين اندماج 1 إلى 1 من المتبرع والمتلقي كمسبار معايرة بتحديد عامل α ويعمل أيضا كعنصر تحكم إيجابي. يتم التعبير عن هذا المسبار المقترن وراثيا بواسطة الخلايا بكميات إجمالية غير معروفة ولكن بكمية نسبية ثابتة ومعروفة من واحد إلى واحد. يحدد البروتوكول التالي كيفية بناء مسبار 1 إلى 1 وكيفية استخدامه لقياس كفاءة RET. يمكن العثور على جدول بيانات يتضمن جميع الصيغ في الملحق ويمكن استخدامه من قبل القراء لإدخال قياساتهم الخاصة في الأعمدة المعنية كما هو موضح أدناه.
بينما يستخدم البروتوكول زوج مانح / متقبل GFP-Cherry ، يمكن تنفيذ النهج المقدم مع أي زوج FRET آخر. يقدم الملف التكميلي 1 تفاصيل عن أزواج السماوي والأصفر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

نقل طاقة الرنين Förster (FRET) هو نقل الطاقة بدون إشعاع من متبرع متحمس إلى جزيء متقبل ويعتمد على مسافة واتجاه الجزيئات بالإضافة إلى مدى التداخل بين انبعاث المانحين وأطياف امتصاص المستقبل. يسمح الحنق بدراسة تفاعل البروتينات في الخلية الحية بمرور الوقت وفي المقصورات تحت الخلوية المختلفة. تم وصف خوارزميات مختلفة قائمة على الشدة لقياس FRET باستخدام الفحص المجهري في الأدبيات. هنا ، يتم توفير بروتوكول وخوارزمية لتحديد كفاءة FRET بناء على قياس كل من الانبعاث الحساس للمتلقي وإخماد جزيء المتبرع. لا يتطلب القياس الكمي للفريت النسبي في الخلية الحية فقط تحديد الحديث المتبادل (الانسكاب الطيفي ، أو النزيف) للبروتينات الفلورية ولكن أيضا كفاءة الكشف عن الإعداد المجهري. ويفصل البروتوكول المقدم هنا كيفية تقييم هذه البارامترات الحاسمة.

يوضح الشكل 1 الصور التي تم الحصول عليها في القناة المانحة ، القناة 1 (488 ، 505-530 نانومتر) ، قناة النقل ، القناة 2 (488 ، >585 نانومتر) ، وقناة المستقبل ، القناة 3 (561 ، >585 نانومتر) ، على التوالي. صور تمثيلية للخلايا التي تعبر عن GFP فقط ، الكرز فقط ، والتعبير المشترك عن GFP...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

يمكن استخدام نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين جزيئين من الفلوروفور لدراسة تفاعلات البروتين في الخلية الحية. هنا ، يتم توفير بروتوكول حول كيفية قياس FRET في الخلايا الحية عن طريق الكشف عن الانبعاث الحساس للمستقبل وإخماد جزيء المتبرع باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

تقييم تفاعلات البروتين في الخلايا الحية مع انبعاث الحنق الحساس

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

يصف هذا البروتوكول عملية تجريبية خطوة بخطوة وخوارزمية رياضية لقياس FRET باستخدام تبريد المانحين والانبعاثات الحساسة المتقبلة. يتطلب القياس الكمي لكفاءات FRET في الخلية الحية تحديد الحديث المتبادل للبروتينات الفلورية والانبعاث النسبي وكفاءة الكشف عن الفلوروفورات في الإعداد المجهري. يمكن تقييم الحديث المتبادل عن طريق تصوير الخلايا التي تعبر عن فلوروفور واحد فقط.يتطلب تقييم كفاءة الكشف عن جزيء مانح أو متقبل معرفة نسبة عدد جزيئات المتبرع والمستقبل التي تؤدي إلى إشارة القياس. يختلف عدد الفلوروفورات المعبر عنها في الخلايا الحية من خلية إلى أخرى وهو غير معروف. مسبار المعايرة المستخدم في هذه الطريقة ، وهو بروتين اندماج واحد لواحد بين المتبرعين والمستقبلين ، يجعل من الممكن تحديد كفاءة الكشف النسبية لجزيئات المتبرع والمستقبل.للبدء ، استخدم متجه تعبير خلية الثدييات N1 مع mCherry 1 لتوليد مسبار الاندماج EGFP mCherry 1. صمم قليل النيوكليوتيدات لتضخيم EGFP بدون كودون توقف كخلية واحدة جزء BAM h1. يجب أن ينتج عن رابط الأحماض الأمينية الخمسة بين البروتين الفلوري الأخضر والأحمر نقص متوسط FRET لزوج مانح الكرز GFP من 0.25 إلى 0.3.استخدم أي خط خلوي ووسائط بدون الفينول الأحمر لتقليل مضان الخلفية. بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، افصلها بمليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين EDTA وزرع حوالي 10،000 خلية في كل بئر من صفيحة ثمانية آبار عن طريق إضافة ثلاث قطرات من تعليق خلية خمسة ملليلترات. بعد 24 ساعة من الطلاء ، قم بنقل الخلايا باستخدام وسائط نقل مناسبة.احتضان الخلايا لمدة 20 ساعة قبل تصوير الخلايا الحية للسماح بالتعبير المناسب عن البروتين الفلوري والطي والنضج. تخيل الخلايا في غرفة بيئية مرطبة ومدفأة عند 37 درجة مئوية باستخدام مجهر مسح متحد البؤر. لتخزين وسائط الخلية عند درجة الحموضة الفسيولوجية ، أضف 20 مللي مولار HEPES لجعل ثاني أكسيد الكربون في وسائط الخلية مستقلا.ثم قم بتركيب الشريحة على المجهر. استخدم خط 488 نانومتر من ليزر أيون الأرجون لإثارة GFP وليزر الصمام الثنائي 561 نانومتر لإثارة الكرز. قم بإعداد ليزر 488 نانومتر للإثارة في القناة الأولى من خلال نطاق انبعاث من 505 إلى 530 نانومتر وفي القناة الثانية مع مرشح تمرير طويل يزيد عن 585 نانومتر.استخدم ليزر 561 نانومتر للإثارة في القناة الثالثة مع مرشح تمرير طويل يزيد عن 585 نانومتر. قم بإثارة الليزرين بالتتابع واضبط وضع التصوير للتبديل بعد كل سطر بحيث يتناوب إثارة الصورة 512 × 512 بكسل بعد كل سطر. قم بإعداد سلسلة زمنية مصغرة من ثلاث صور لاكتشاف ما إذا كان هناك تبييض ضوئي كبير وتقليل طاقة الليزر إذا لزم الأمر.أولا ، خلايا الصورة التي تعبر عن بنية اندماج الكرز GFP. قم بتعيين المعلمات التي تحدد كثافة الليزر المتكاملة زمنيا لكل بكسل في صورة متحدة البؤر. استخدم هدف زيت 63X وقم بضبط التكبير / التصغير على 3X لتصوير خلية بالكامل بتكبير ودقة كافيين.استهدف حجم بكسل من 70 إلى 80 نانومتر. اضبط وقت بقاء البكسل على اثنين إلى أربعة ميكروثانية ونقل AOTF لليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر بحيث تظهر الصور نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة دون أي تبييض ولا توجد وحدات بكسل تشير إلى تشبع شدة التألق. اضبط طاقة الليزر 488 و 561 بحيث تكون مستويات الإشارة في القناة الأولى والقناة الثالثة متشابهة.اضبط كسب مضاعف الصورة على 600 إلى 800. صورة من 15 إلى 20 خلية تعبر عن بروتين اندماج الكرز GFP ، والخلايا التي تعبر عن GFP ، والكرز ، و GFP والكرز ، والخلايا غير المعبرة. ثم خلايا الصورة تشارك في التعبير عن البروتينات ذات الأهمية إلى جانب GFP والكرز على التوالي.لحساب FRET ، قم بقياس إشارة المتبرع في القناة الأولى ، القناة المانحة بإثارة 488 نانومتر ونطاق انبعاث من 505 إلى 530 نانومتر. ثم قم بقياس إشارة المستقبل في القناة الثالثة ، قناة المستقبل ذات الإثارة والانبعاث 561 نانومتر فوق 585 نانومتر. أخيرا ، قم بقياس إشارة FRET في القناة الثانية ، قناة النقل ذات الإثارة والانبعاث 488 نانومتر عند أعلى من 585 نانومتر.الإشارة في القناة الثانية هي مجموع أربعة مكونات مختلفة: الامتداد الطيفي من إشارة المتبرع المروي إلى قناة الكشف التي تزيد عن 585 مع عامل الحديث المتبادل S1 ، إشارة المستقبل من الإثارة المباشرة بواسطة ضوء 488 نانومتر مع عامل الحديث المتبادل S2 ، الانبعاث الحساس للمتقبل بواسطة FRET من جزيء المتبرع المتحمس ، وإشارة الخلفية. تم الحصول على الصور في القناة المانحة ، وقناة النقل ، والقناة المستقبلة ، والخلايا التي تعبر عن GFP فقط ، والكرز فقط ، والتعبير المشترك عن GFP والكرز ، وبروتين اندماج الكرز GFP. يتم رسم متوسط كفاءات FRET الخلوية المحسوبة في خلايا NRK التي تعبر عن بروتين اندماج الكرز GFP وتلك التي تعبر عن كرز GFP مقابل نسبة كثافة نسبة المتقبل إلى المتبرع أو النسبة الجزيئية في كل خلية.يتم عرض صور الحنق بالبكسل الطبيعية للخلايا التي تعبر عن بروتين اندماج الكرز GFP ، والتعبير المشترك عن GFP والكرز كعنصر تحكم سلبي ، والتعبير عن الوحدات الفرعية للمستقبلات لمستقبلات Ashwell-Morell هنا. تم تمييز RHL1 و 2 من الليكتين الكبدي للفئران ب GFP والكرز على الجانب السيتوبلازمي من غشاء البلازما. يتم رسم متوسط كفاءات الحنق الخلوي للخلايا التي تعبر عن GFP RHL1 والكرز RHL2 و GFP RHL1 دلتا الأسهم والكرز RHL2 مقابل النسبة الجزيئية المتقبلة إلى المانحة.يسمح نهج FRET الكمي المقدم بما يلي. الكشف عن تفاعلات البروتين في السياق الفسيولوجي للخلية الحية. التغيرات في تفاعلات البروتين مع مرور الوقت.الاختلافات في التفاعلات في المقصورات تحت الخلوية وصولا إلى مستوى البكسل حسب مستوى البكسل للصورة متحدة البؤر. واعتماد إشارة FRET المكتشفة على نسبة المستقبل الجزيئي إلى المتبرع المعبر عنها في خلية حية.