Vi vil gerne takke Neuroscience Imaging Service ved Stanford University School of Medicine for at levere udstyr og plads til dette projekt. Denne forskning blev støttet af intramural finansiering af Stanford Cancer Institute og Gynecologic Oncology Division Stanford samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 fra National Research, Development and Innovation Office, Ungarn.

1. Plasmid konstruktion
<ol><li>Til generering af fusionssonden eGFP-mCherry1 skal du bruge en N1-pattedyrcelleekspressionsvektor (se materialetabellen) med mCherry110 indsat ved hjælp af restriktionsstederne AgeI og BsrGI.</li>
	<li>Brug følgende oligonukleotider til at forstærke eGFP11 uden stopkodon som SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' og C-terminal primer 5'-AAT A...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

Den præsenterede protokol beskriver brugen af den genetisk koblede en-til-en fluorescerende proteinkalibreringssonde til kvantificering af FRET ved påvisning af sensibiliseret emission af acceptoren og slukning af donormolekylet ved konfokal mikroskopi. Denne metode kan anvendes til at vurdere proteininteraktioner i den fysiologiske kontekst af den levende celle i forskellige subcellulære rum. Den rumlige opløsning kan forbedres yderligere ved at anvende den præsenterede algoritme til at beregne FRET-effektivitet i ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Mikroskopibaseret analyse af Förster Resonance Energy Transfer (FRET) muliggør vurdering af interaktioner mellem proteiner i levende celler. Det giver rumlig og tidsmæssig information, herunder information om hvor i cellen og i hvilket subcellulært rum interaktionen finder sted, og hvis denne interaktion ændrer sig over tid.
Theodor Förster lagde det teoretiske grundlag for FRET i 19481. FRET er en strålingsfri overførsel af energi fra en exciteret donor til et acceptormolekyle og afhænger af molekylernes afstand og den relative orientering af deres overgangsdipoler samt overlapningen mellem donoremissions- og acceptorabsorptionsspektrene. Energioverførselshastigheden er omvendt proportional med den sjette effekt af donoracceptorafstanden. FRET kan således anvendes til at måle molekylær nærhed i området 1-10 nm.
FRET konkurrerer med andre de-excitationsprocesser af donormolekylet og resulterer i den såkaldte donor-quenching og sensibiliserede emission af acceptoren. Donor-slukning er en reduktion af antallet af udsendte donorfotoner, mens sensibiliseret emission er en stigning i udsendte acceptorfotoner. Mange mikroskopiske FRET-analyser bruger fluorescensintensitetsmålinger, herunder acceptorfotoblegning 2, donorfotoblegning2 eller FRET-sensibiliseret fotoblegning af acceptoren3.
Her præsenteres en trin-for-trin eksperimentel protokol og matematisk algoritme til kvantificering af FRET ved hjælp af donorslukning og acceptorsensibiliseret emission4,5, en metode, der ofte omtales som ratiometrisk FRET. Mange protokoller om, hvordan man tilnærmer sensibiliseret emission er blevet offentliggjort, få har kvantificeret den absolutte FRET-effektivitet 6,7,8,9. Kvantificeringen af FRET-effektiviteten i den levende celle kræver bestemmelse af (i) krydstale (spektral spill-over eller gennemblødning) af de fluorescerende proteiner og også (ii) detektionseffektiviteten af den mikroskopiske opsætning. Mens krydstale kan vurderes ved at billeddannende celler, der kun udtrykker en af fluoroforerne, er vurderingen af donorens og acceptorfluorescensens relative detektionseffektivitet mere kompliceret. Det kræver kendskab til mindst forholdet mellem antallet af donor- og acceptormolekyler, der giver anledning til de målte signaler. Antallet af fluoroforer udtrykt i levende celler varierer imidlertid fra celle til celle og er ukendt. Den såkaldte α faktor karakteriserer de relative signalstyrker fra et enkelt exciteret donor- og acceptormolekyle. Kendskab til faktoren er en forudsætning for kvantitative ratiometriske FRET-målinger i prøver med variable acceptor-til-donor-molekyleforhold, som det ses under levende cellebilleddannelse med fluorescerende proteiner. Brug af et 1-til-1 donoracceptorfusionsprotein som kalibreringssonde muliggør bestemmelse af α faktor og fungerer også som en positiv kontrol. Denne genetisk koblede sonde udtrykkes af celler i ukendte samlede mængder, men i en fast og kendt relativ mængde en-til-en. Følgende protokol beskriver, hvordan 1-til-1-sonden konstrueres, og hvordan den bruges til kvantificering af FRET-effektivitet. Et regneark, der indeholder alle formler, findes i tillægget og kan bruges af læserne til at indtaste deres egne mål i de respektive kolonner som beskrevet nedenfor.
Mens protokollen bruger GFP-Cherry donor / acceptorparret, kan den præsenterede tilgang udføres med ethvert andet FRET-par. Den supplerende fil 1 indeholder nærmere oplysninger om cyangule par.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er den strålingsfri overførsel af energi fra en exciteret donor til et acceptormolekyle og afhænger af molekylernes afstand og orientering samt omfanget af overlapning mellem donoremissions- og acceptorabsorptionsspektrene. FRET tillader at studere interaktionen mellem proteiner i den levende celle over tid og i forskellige subcellulære rum. Forskellige intensitetsbaserede algoritmer til måling af FRET ved hjælp af mikroskopi er beskrevet i litteraturen. Her tilvejebringes en protokol og en algoritme til kvantificering af FRET-effektivitet baseret på måling af både den sensibiliserede emission af acceptoren og slukning af donormolekylet. Kvantificeringen af ratiometrisk FRET i den levende celle kræver ikke kun bestemmelse af krydstale (spektral spill-over eller gennemblødning) af de fluorescerende proteiner, men også detektionseffektiviteten af den mikroskopiske opsætning. Protokollen her beskriver, hvordan man vurderer disse kritiske parametre.

Figur 1 viser billederne opnået i henholdsvis donorkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), overførselskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) og acceptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Repræsentative billeder af celler, der kun udtrykker GFP, kun kirsebær, der udtrykker GFP og kirsebær og udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet. De gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitetsgevinster beregnet i NRK-celler, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsprotein (positiv kontrol, fi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem to fluoroformolekyler kan bruges til at studere proteininteraktioner i den levende celle. Her tilvejebringes en protokol for, hvordan man måler FRET i levende celler ved at detektere sensibiliseret emission af acceptoren og slukning af donormolekylet ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi.

Vurdering af proteininteraktioner i levende celler med FRET-sensibiliseret emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Denne protokol beskriver en trin-for-trin eksperimentel proces og matematisk algoritme til kvantificering af FRET ved hjælp af donorslukning og acceptorsensibiliseret emission. Kvantificeringen af FRET-effektiviteten i den levende celle kræver bestemmelse af krydstalen af de fluorescerende proteiner og den relative emissions- og detektionseffektivitet af fluoroforerne i den mikroskopiske opsætning. Krydstale kan vurderes ved at billeddanne celler, der kun udtrykker en fluorofor.Vurdering af en donors eller et acceptormolekyles detektionseffektivitet kræver kendskab til forholdet mellem antallet af donor- og acceptmolekyler, der giver anledning til målesignalet. Antallet af fluoroforer udtrykt i levende celler varierer fra celle til celle og er ukendt. Kalibreringssonden, der anvendes i denne metode, et en-til-en donoracceptorfusionsprotein, gør det muligt at bestemme den relative detektionseffektivitet af donor- og acceptormolekyler.Til at begynde med skal du bruge en N1-pattedyrcelleekspressionsvektor med mCherry 1 til generering af EGFP mCherry 1-fusionssonden. Design oligonukleotider til at forstærke EGFP uden stopkodon som et celle et BAM h1-fragment. De fem aminosyreforbindelser mellem det grønne og røde fluorescerende protein bør give en gennemsnitlig FRET-mangel for GFP-kirsebærdonoracceptorparret på 0,25 til 0,3.Brug enhver cellelinje og medier uden phenolrød til at reducere baggrundsfluorescens. Når cellerne er 80% sammenflydende, løsnes de med en milliliter 0, 05% trypsin EDTA og frø ca. 10.000 celler i hver brønd i en otte-brøndplade ved at tilsætte tre dråber fra en fem milliliter cellesuspension. 24 timer efter plettering transfekteres cellerne ved hjælp af et passende transfektionsmedie.Inkuber cellerne i 20 timer før levende cellebilleddannelse for at muliggøre korrekt fluorescerende proteinekspression, foldning og modning. Tag billeder af cellerne i et befugtet og opvarmet miljøkammer ved 37 grader Celsius med et konfokal scanningsmikroskop. For at buffere cellemediet ved fysiologisk pH tilsættes 20 millimolær HEPES for at gøre cellemediet kuldioxiduafhængigt.Monter derefter diaset på mikroskopet. Brug 488 nanometerlinjen i argonionlaseren til at excitere GFP og 561 nanometer diodelaseren til at excitere kirsebær. Opsæt 488 nanometer laseren til excitation i kanal et gennem et emissionsbånd på 505 til 530 nanometer og i kanal to med et langt pasfilter på over 585 nanometer.Brug 561 nanometer laseren til excitation i kanal tre med et langt pass filter på over 585 nanometer. Excite de to lasere sekventielt, og indstil billedbehandlingstilstanden til at skifte efter hver linje, så excitationen af billedet på 512 x 512 pixel skifter efter hver linje. Opret en minitidsserie på tre billeder for at registrere, om der forekommer væsentlig fotoblegning, og reducer lasereffekten, hvis det er nødvendigt.For det første billedceller, der udtrykker GFP kirsebærfusionskonstruktionen. Indstil de parametre, der definerer tidsintegreret laserintensitet pr. pixel i et konfokalbillede. Brug et 63X oliemål, og zoom indstillet til 3X til at afbilde en celle i sin helhed med tilstrækkelig forstørrelse og opløsning.Sigt efter en pixelstørrelse på 70 til 80 nanometer. Indstil pixelopholdstiden til to til fire mikrosekunder og AOTF-transmission for 488 nanometer og 561 nanometer laser, således at billeder viser et godt signal-støj-forhold uden blegning og ingen pixels, der angiver fluorescensintensitetsmætning. Juster lasereffekten på 488 og 561, så signalniveauerne i kanal et og kanal tre er ens.Indstil fotomultiplikatorforstærkningen til 600 til 800. Billede 15 til 20 celler, der udtrykker GFP kirsebærfusionsproteinet, celler, der udtrykker GFP, kirsebær, GFP og kirsebær og ikke-transekterede celler. Derefter billedceller, der co-udtrykker proteinerne af interesse koblet til henholdsvis GFP og kirsebær.For at beregne FRET måles donorsignalet i kanal et, donorkanalen med 488 nanometer excitation og et emissionsbånd på 505 til 530 nanometer. Mål derefter acceptorsignalet i kanal tre, acceptorkanalen med 561 nanometer excitation og emission ved over 585 nanometer. Endelig måles FRET-signalet i kanal to, overførselskanalen med 488 nanometer excitation og emission ved over 585 nanometer.Signalet i kanal to er en sum af fire forskellige komponenter: spektralafsmitningen fra det slukkede donorsignal til over 585-detektionskanalen med en krydstalefaktor S1, acceptorsignalet fra direkte excitation med 488 nanometer lys med en krydstalefaktor S2, den sensibiliserede emission af acceptoren fra FRET fra det ophidsede donormolekyle, og baggrundssignalet. Billeder blev opnået i donorkanalen, overførselskanalen og acceptorkanalen, celler, der kun udtrykker GFP, kun kirsebær, co-udtrykker GFP og kirsebær, og GFP kirsebærfusionsproteinet vises. De gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitetsgevinster beregnet i NRK-celler, der udtrykker GFP-kirsebærfusionsprotein, og dem, der co-udtrykker GFP-kirsebær, plottes versus acceptor-til-donor-forholdets intensitetsforhold eller molekylforhold i hver celle.Normaliserede pixel for pixel FRET-billeder af celler, der udtrykker GFP-kirsebærfusionsproteinet, co-udtrykker GFP og kirsebær som en negativ kontrol og udtrykker receptorunderenheder af Ashwell-Morell-receptoren vises her. RHL1 og 2 af rotteleverlektin blev mærket med GFP og kirsebær på den cytoplasmatiske side af plasmamembranen. Den gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitet af celler, der udtrykker GFP RHL1 og kirsebær RHL2 og GFP RHL1 deltabestand og kirsebær RHL2, plottes versus acceptor-til-donor-molekylforholdet.Den fremlagte kvantitative FRET-metode giver mulighed for følgende. Påvisning af proteininteraktioner i den levende celles fysiologiske sammenhæng. Ændringer i proteininteraktioner over tid.Forskelle i interaktioner i subcellulære rum ned til pixel for pixel-niveau af et konfokal billede. Og afhængigheden af det detekterede FRET-signal af det molekylære acceptor-til-donor-forhold udtrykt i en levende celle.