Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est le transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance et de l’orientation des molécules ainsi que de l’étendue du chevauchement entre les spectres d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur. FRET permet d’étudier l’interaction des protéines dans la cellule vivante au fil du temps et dans différents compartiments subcellulaires. Différents algorithmes basés sur l’intensité pour mesurer FRET à l’aide de la microscopie ont été décrits dans la littérature. Ici, un protocole et un algorithme sont fournis pour quantifier l’efficacité FRET basée sur la mesure à la fois de l’émission sensibilisée de l’accepteur et de la trempe de la molécule donneuse. La quantification du FRET ratiométrique dans la cellule vivante nécessite non seulement la détermination de la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes, mais aussi l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Le protocole fourni ici détaille comment évaluer ces paramètres critiques.