Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist die strahlungslose Übertragung von Energie von einem angeregten Donor auf ein Akzeptormolekül und hängt vom Abstand und der Ausrichtung der Moleküle sowie dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. FRET ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen in der lebenden Zelle im Laufe der Zeit und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu untersuchen. In der Literatur wurden verschiedene intensitätsbasierte Algorithmen zur Messung von FRET mittels Mikroskopie beschrieben. Hier werden ein Protokoll und ein Algorithmus zur Quantifizierung der FRET-Effizienz bereitgestellt, die sowohl auf der Messung der sensibilisierten Emission des Akzeptors als auch der Abschreckung des Donormoleküls basieren. Die Quantifizierung der ratiometrischen FRET in der lebenden Zelle erfordert nicht nur die Bestimmung des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine, sondern auch die Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie diese kritischen Parameter zu bewerten sind.