ברצוננו להודות לשירות הדימות של מדעי המוח בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד על אספקת ציוד ומקום לפרויקט זה. מחקר זה נתמך על ידי מימון פנימי של מכון הסרטן של סטנפורד והחטיבה האונקולוגית הגינקולוגית בסטנפורד, כמו גם GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 מהמשרד הלאומי למחקר, פיתוח וחדשנות, הונגריה.

1. בניית פלסמיד
<ol><li>ליצירת בדיקת ההיתוך eGFP-mCherry1, השתמש בווקטור ביטוי תאי יונקים N1 (ראה טבלת חומרים) עם mCherry110 שהוכנס באמצעות אתרי ההגבלה AgeI ו - BsrGI.</li>
	<li>השתמש באוליגונוקלאוטידים הבאים כדי להגביר את eGFP11 ללא קודון עצירה כקטע SalI-BamHI : פריימר N-term...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג מפרט את השימוש בבדיקת כיול חלבון פלואורסצנטי מצומד גנטית אחד לאחד לכימות FRET באמצעות זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי להעריך אינטראקציות חלבונים בהקשר הפיזיולוגי של התא החי בתאים תת-תאיים שונים. נ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

ניתוח מבוסס מיקרוסקופיה של Förster Resonance Energy Transfer (FRET) מאפשר הערכה של אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. הוא מספק מידע מרחבי וזמני, כולל מידע על היכן בתא ובאיזה תא תת-תאי מתרחשת האינטראקציה ואם אינטראקציה זו משתנה עם הזמן.
תיאודור פורסטר הניח את הבסיס התאורטי של FRET בשנת 19481. FRET היא העברה ללא קרינה של אנרגיה מתורם נרגש למולקולת קבלה, והיא תלויה במרחק המולקולות ובאוריינטציה היחסית של דיפולי המעבר שלהן, כמו גם בחפיפה בין ספקטרום פליטת התורם לספקטרום קליטת המקבל. קצב העברת האנרגיה עומד ביחס הפוך לחזקה השישית של מרחק התורם-מקבל. לפיכך, FRET יכול לשמש למדידת קרבה מולקולרית בטווח של 1-10 ננומטר.
FRET מתחרה בתהליכי עירור אחרים של מולקולת התורם ומביא למה שמכונה פליטה מרוותה ורגישה של התורם של המקבל. מרווה מתורם היא הפחתה של מספר פוטוני התורם הנפלטים, בעוד פליטה רגישה היא עלייה בפוטונים הקולטים הנפלטים. ניתוחי FRET מיקרוסקופיים רבים משתמשים במדידות עוצמת פלואורסצנטיות, כולל הלבנה פוטואורסצנטית של המקבל 2, הלבנה פוטו-לוגית של תורם2, או הלבנה פוטו-רגישה ל-FRET של המקבל3.
כאן, פרוטוקול ניסויי שלב אחר שלב ואלגוריתם מתמטי מוצגים כדי לכמת FRET באמצעות מרווה תורם ומקבל פליטה רגישה4,5, שיטה המכונה לעתים קרובות FRET יחסי. פרוטוקולים רבים כיצד להעריך פליטה רגישה פורסמו, מעטים כימתו את יעילות FRET המוחלטת 6,7,8,9. כימות יעילות FRET בתא החי דורש לקבוע (i) את crosstalk (זליגה ספקטרלית, או דימום דרך) של החלבונים הפלואורסצנטיים, וגם (ii) את יעילות הזיהוי של המערך המיקרוסקופי. בעוד שניתן להעריך דיבור צולב על ידי תאי הדמיה המבטאים רק אחד מהפלואורופורים, הערכת יעילות הזיהוי היחסית של התורם והפלואורסצנטיות המקבלת מורכבת יותר. זה דורש ידע של לפחות את היחס בין מספר מולקולות תורם ומקבל היוצר את האותות הנמדדים. עם זאת, מספר הפלואורופורים המבוטאים בתאים חיים משתנה מתא לתא ואינו ידוע. מה שמכונה גורם α מאפיין את עוצמות האות היחסיות ממולקולת תורם ומקבל נרגשת אחת. ידיעת הגורם היא תנאי מוקדם למדידות FRET יחסיות כמותיות בדגימות עם יחסי מולקולות משתנים בין קבלה לתורם, כפי שנתקלים בהן במהלך הדמיה של תאים חיים עם חלבונים פלואורסצנטיים. שימוש בחלבון היתוך 1 ל-1 תורם-מקבל כבדיקת כיול מאפשר קביעת גורם α ומשמש גם כבקרה חיובית. בדיקה מצומדת גנטית זו מבוטאת על ידי תאים בכמויות כוללות לא ידועות אך בכמות יחסית קבועה וידועה של אחד לאחד. הפרוטוקול הבא מפרט כיצד לבנות את הגשושית 1 ל-1 וכיצד להשתמש בה לכימות יעילות FET. גיליון אלקטרוני הכולל את כל הנוסחאות נמצא במוסף ויכול לשמש את הקוראים כדי להזין את המידות שלהם בעמודות המתאימות כמפורט להלן.
בעוד שהפרוטוקול משתמש בזוג התורם/מקבל GFP-Cherry, ניתן לבצע את הגישה המוצגת עם כל זוג FRET אחר. הקובץ המשלים 1 מספק פרטים על זוגות ציאן-צהוב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) היא העברת אנרגיה ללא קרינה מתורם נרגש למולקולה מקבלת ותלויה במרחק ובכיוון של המולקולות, כמו גם במידת החפיפה בין ספקטרום פליטת התורם לספקטרום קליטת המקבל. FRET מאפשר לחקור את האינטראקציה של חלבונים בתא החי לאורך זמן ובתאים תת-תאיים שונים. אלגוריתמים שונים מבוססי עוצמה למדידת FRET באמצעות מיקרוסקופיה תוארו בספרות. כאן, פרוטוקול ואלגוריתם מסופקים לכימות יעילות FRET בהתבסס על מדידת הפליטה הרגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם. הכימות של FRET יחסימטרי בתא החי דורש לא רק את קביעת הקרוס-טוק (זליגה ספקטרלית, או דימום) של החלבונים הפלואורסצנטיים, אלא גם את יעילות הזיהוי של המערך המיקרוסקופי. הפרוטוקול המובא כאן מפרט כיצד להעריך פרמטרים קריטיים אלה.

איור 1 מציג את התמונות שהתקבלו בערוץ התורם, ערוץ 1 (488, 505-530 ננומטר), ערוץ ההעברה, ערוץ 2 (488, >585 ננומטר) וערוץ המקבל, ערוץ 3 (561, >585 ננומטר), בהתאמה. תמונות מייצגות של תאים המבטאים GFP בלבד, דובדבן בלבד, המבטאים במשותף GFP ודובדבן, ומבטאים את חלבון ההיתוך GFP-Cherry. יעילות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission at JoVE.com

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסויי שלב אחר שלב ואלגוריתם מתמטי לכימות FRET באמצעות מרווה של תורמים ופליטה רגישה למקבל. כימות יעילות FRET בתא החי מחייב קביעת ההצלבה בין החלבונים הפלואורסצנטיים ויעילות הפליטה והגילוי היחסית של הפלואורופורים במערך המיקרוסקופי. Crosstalk ניתן להעריך על ידי תאי הדמיה המבטאים רק פלואורופור אחד.הערכת יעילות הזיהוי של מולקולה תורמת או מולקולה מקבלת דורשת ידע על היחס בין מספר המולקולות התורמות והמקבלות היוצרות את אות המדידה. מספר הפלואורופורים המבוטאים בתאים חיים משתנה מתא לתא ואינו ידוע. בדיקת הכיול המשמשת בשיטה זו, חלבון היתוך תורם-מקבל אחד-אחד, מאפשרת לקבוע את יעילות הזיהוי היחסית של מולקולות תורם ומקבל.כדי להתחיל, השתמש בווקטור ביטוי תאי יונקים N1 עם mCherry 1 ליצירת בדיקת ההיתוך EGFP mCherry 1. תכנן אוליגונוקלאוטידים להגברת EGFP ללא קודון עצירה כמקטע BAM h1 של תא אחד. חמש חומצות האמינו המקשרות בין החלבון הפלואורסצנטי הירוק והאדום אמורות להניב מחסור ממוצע ב-FRET עבור זוג תורמים-מקבלים דובדבן GFP של 0.25 עד 0.3.השתמש בכל קו תא ומדיה ללא אדום פנול כדי להפחית פלואורסצנטיות ברקע. ברגע שהתאים נפגשים ב-80%, נתקו אותם עם מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA וזרעו כ-10,000 תאים לכל באר של צלחת בעלת שמונה בארות על ידי הוספת שלוש טיפות מתרחיף של חמישה מיליליטר. 24 שעות לאחר הציפוי, יש לבצע טרנספקציה של התאים באמצעות אמצעי טרנספקציה מתאים.יש לדגור על התאים במשך 20 שעות לפני הדמיית תאים חיים כדי לאפשר ביטוי תקין של חלבונים פלואורסצנטיים, קיפול והבשלה. דמיינו את התאים בתא סביבתי לח ומחומם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות מיקרוסקופ סורק קונפוקלי. כדי לאגור את מדיה התא ב pH פיזיולוגי, להוסיף HEPES 20 מילימולרי כדי להפוך את מדיה התא פחמן דו חמצני עצמאי.לאחר מכן הרכיבו את המגלשה על המיקרוסקופ. השתמש בקו 488 ננומטר של לייזר יון ארגון כדי לעורר את GFP ובלייזר דיודה 561 ננומטר כדי לעורר דובדבן. הגדר את הלייזר 488 ננומטר לעירור בערוץ הראשון דרך רצועת פליטה של 505 עד 530 ננומטר ובערוץ השני עם מסנן מעבר ארוך של מעל 585 ננומטר.השתמש בלייזר 561 ננומטר לעירור בתעלה שלוש עם מסנן מעבר ארוך של מעל 585 ננומטר. הרגש את שני הלייזרים ברצף והגדר את מצב ההדמיה לעבור אחרי כל שורה, כך שהעירור של התמונה בגודל 512 על 512 פיקסלים יתחלף לאחר כל שורה. הגדר מיני סדרת זמן של שלוש תמונות כדי לזהות אם מתרחשת הלבנה משמעותית ולהפחית את עוצמת הלייזר במידת הצורך.ראשית, תאי תמונה המבטאים את מבנה היתוך הדובדבן GFP. קבעו את הפרמטרים המגדירים עוצמת לייזר משולבת זמן לפיקסל בתמונה קונפוקלית. השתמש במטרה שמן של 63X והגדר זום ל- 3X כדי לצלם תא בשלמותו עם הגדלה ורזולוציה מספיקות.כוונו לגודל פיקסלים של 70 עד 80 ננומטר. הגדר את זמן השהייה של פיקסלים לשתיים עד ארבע מיקרו-שניות ואת שידור AOTF עבור לייזר 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, כך שהתמונות יציגו יחס אות לרעש טוב ללא הלבנה וללא פיקסלים המציינים רוויה בעוצמת פלואורסצנטיות. התאם את עוצמת הלייזר של 488 ו- 561 כך שרמות האות בערוץ הראשון ובערוץ השלישי יהיו דומות.הגדר את רווח מכפיל התמונות ל- 600 עד 800. תמונה 15 עד 20 תאים המבטאים את חלבון היתוך הדובדבן GFP, תאים המבטאים GFP, דובדבן, GFP ודובדבן, ותאים שאינם עוברים טרנסקטציה. לאחר מכן תאי תמונה מבטאים במשותף את החלבונים המעניינים המצומדים ל-GFP ולדובדבן בהתאמה.כדי לחשב FRET, מדדו את אות התורם בערוץ הראשון, בערוץ התורם עם עירור של 488 ננומטר ורצועת פליטה של 505 עד 530 ננומטר. לאחר מכן מדוד את אות המקבל בערוץ שלוש, ערוץ המקבל עם עירור ופליטה של 561 ננומטר מעל 585 ננומטר. לבסוף, מדוד את אות FRET בערוץ השני, ערוץ ההעברה עם עירור ופליטה של 488 ננומטר מעל 585 ננומטר.האות בערוץ השני הוא סכום של ארבעה מרכיבים שונים: הזליגה הספקטרלית מהאות התורם המרווה לערוץ הגילוי מעל 585 עם גורם crosstalk S1, האות המקבל מעירור ישיר על ידי 488 ננומטר אור עם גורם crosstalk S2, הפליטה הרגישה של המקבל על ידי FRET ממולקולת התורם הנרגשת, ואות הרקע. התמונות התקבלו בערוץ התורם, בערוץ ההעברה ובערוץ המקבל, תאים המבטאים GFP בלבד, דובדבן בלבד, ביטוי משותף של GFP ודובדבן, וחלבון היתוך דובדבן GFP. יעילות ה-FRET התאית הממוצעת המחושבת בתאי NRK המבטאים חלבון היתוך דובדבן GFP ובתאי דובדבן GFP המבטאים במשותף משורטטת לעומת יחס העוצמה בין המקבל לתורם או היחס המולקולרי בכל תא.תמונות FRET מנורמלות של פיקסלים אחר פיקסלים של תאים המבטאים את חלבון היתוך הדובדבן GFP, מבטאים במשותף GFP ודובדבן כבקרה שלילית, ומבטאים תת-יחידות קולטן של קולטן אשוול-מורל מוצגות כאן. RHL1 ו-2 של לקטין הכבד של החולדה סומנו עם GFP ודובדבן בצד הציטופלזמי של קרום הפלזמה. יעילות ה-FRET התאית הממוצעת של תאים המבטאים GFP RHL1 ודובדבן RHL2 ו-GFP RHL1 מלאי דלתא ודובדבן RHL2 משורטטת לעומת היחס המולקולרי בין המקבל לתורם.גישת FRET הכמותית המוצגת מאפשרת את הדברים הבאים. זיהוי אינטראקציות חלבוניות בהקשר הפיזיולוגי של התא החי. שינויים באינטראקציות חלבונים לאורך זמן.הבדלים באינטראקציות בתאים תת-תאיים עד לרמת פיקסל אחר פיקסל של תמונה קונפוקלית. והתלות של אות FRET שזוהה ביחס המולקולרי בין קבלה לתורם המתבטא בתא חי.