Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è il trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza e dall'orientamento delle molecole, nonché dall'entità della sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell'accettore. FRET permette di studiare l'interazione delle proteine nella cellula vivente nel tempo e in diversi compartimenti subcellulari. In letteratura sono stati descritti diversi algoritmi basati sull'intensità per misurare la FRET utilizzando la microscopia. Qui vengono forniti un protocollo e un algoritmo per quantificare l'efficienza FRET sulla base della misurazione sia dell'emissione sensibilizzata dell'accettore che della tempra della molecola donatrice. La quantificazione della FRET raziometrica nella cellula vivente richiede non solo la determinazione della diafonia (spill-over spettrale, o bleed-through) delle proteine fluorescenti, ma anche l'efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Il protocollo fornito qui descrive come valutare questi parametri critici.