이 프로젝트를 위한 장비와 공간을 제공한 Stanford University School of Medicine의 Neuroscience Imaging Service에 감사드립니다. 이 연구는 스탠포드 암 연구소 (Stanford Cancer Institute)와 스탠포드 부인과 종양학 부서 (Gynecologic Oncology Division Stanford)의 교내 자금 지원과 헝가리 국립 연구 개발 혁신 사무소의 GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107의 지원을 받았습니다.

1. 플라스미드 구성
<ol><li>eGFP-mCherry1 융합 프로브를 생성하기 위해, 제한 부위 AgeI 및 BsrGI를 사용하여 mCherry110이 삽입된 N1 포유동물 세포 발현 벡터(재료 표 참조)를 사용합니다.</li>
	<li>다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 정지 코돈 없이 eGFP11 을 SalI-BamHI 단편으로 증폭합니다: N-말단 프라이머 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC...

<ol>
	<li>F&#246;rster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz.">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li><li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+digital+imaging+microscopy.">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li><li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer.">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li><li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+the+c-Fos/c-Jun+complex+in+vivo:+A+combined+FRET,+FCCS,+and+MD-modeling+study.">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li><li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging.">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li><li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission.">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li><li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells.">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).</li><li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quality,+reproducibility,+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors.">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li><li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+measured+by+the+sensitized+emission+method.">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194 (2020).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+(GFP).">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 33-38 (1996).</li><li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins.">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li><li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein.">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li><li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy.">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li><li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis.">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li><li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer.">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li><li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry.">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li><li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+of+EGFP,+EYFP,+and+ECFP+with+high+yield+and+purity.">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li><li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness,+protein+folding,+and+FRET+Forster+radius.">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li><li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs.">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li><li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells.">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270 (2015).</li><li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it.">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li><li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes:+Simulations+and+experiments.">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li></ol>

제시된 프로토콜은 수용체의 민감 방출 검출 및 공초점 현미경에 의한 기증자 분자의 소멸을 사용하여 FRET를 정량화하기 위한 유전적으로 결합된 일대일 형광 단백질 보정 프로브의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 서로 다른 세포 내 구획에 있는 살아있는 세포의 생리학적 맥락에서 단백질 상호작용을 평가하는 데 적용할 수 있습니다. 공간 해상도는 제시된 알고리즘을 적용하여 이미...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster 공명 에너지 전달(FRET)의 현미경 기반 분석을 통해 살아있는 세포에서 단백질 간의 상호 작용을 평가할 수 있습니다. 그것은 세포 내 어디에 있고 어떤 세포 내 구획에서 상호 작용이 일어나는지, 그리고 이 상호 작용이 시간이 지남에 따라 변하는지에 대한 정보를 포함하여 공간 및 시간 정보를 제공합니다.
Theodor Förster는 1948년 FRET의 이론적 토대를 마련했습니다1. FRET는 여기 된 기증자에서 수용체 분자로의 무방사선 에너지 전달이며 분자의 거리와 전이 쌍극자의 상대적 방향, 기증자 방출과 수용체 흡수 스펙트럼 사이의 겹침에 따라 달라집니다. 에너지 전달 속도는 도너-수용체 거리의 6승에 반비례합니다. 따라서 FRET는 1-10nm 범위의 분자 근접성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
FRET는 기증자 분자의 다른 여기 제거 과정과 경쟁하여 수용체의 소위 기증자 담금질 및 감작 방출을 초래합니다. 도너 담금질은 방출된 도너 광자의 수를 감소시키는 반면, 감응 방출은 방출된 수용체 광자의 증가입니다. 많은 현미경 FRET 분석은 수용체 광표백2, 기증자 광표백2 또는 수용체3의 FRET 민감 광표백을 포함한 형광 강도 측정을 사용합니다.
여기에서는 종종 비율계량 FRET라고 하는 방법인 기증자 담금질 및 수용체 감응 방출 4,5를 사용하여 FRET를 정량화하기 위한 단계별 실험 프로토콜과 수학적 알고리즘이 제시됩니다. 감작 방출을 근사화하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 발표되었지만 절대 FRET 효율 6,7,8,9를 정량화한 프로토콜은 거의 없습니다. 살아있는 세포에서 FRET 효율을 정량화하려면 (i) 형광 단백질의 누화(스펙트럼 유출 또는 블리드 스루)와 (ii) 현미경 설정의 검출 효율을 결정해야 합니다. 누화는 형광단 중 하나만 발현하는 이미징 세포로 평가할 수 있지만 공여체 및 수용체 형광의 상대적 검출 효율 평가는 더 복잡합니다. 측정된 신호를 발생시키는 공여체와 수용체 분자의 수의 비율에 대한 지식이 필요합니다. 그러나 살아있는 세포에서 발현되는 형광단의 수는 세포마다 다르며 알려져 있지 않습니다. 소위 α 인자는 단일 여기 기증자 및 수용체 분자의 상대적 신호 강도를 특성화합니다. 인자에 대한 지식은 형광 단백질을 사용한 생세포 이미징 중에 발생하는 가변 수용체-기증자 분자 비율을 가진 샘플에서 정량적 비율계량 FRET 측정을 위한 전제 조건입니다. 1:1 공여체-수용체 융합 단백질을 보정 프로브로 사용하면 α 인자를 측정할 수 있으며 양성 대조군으로도 사용할 수 있습니다. 이 유전적으로 결합된 프로브는 세포에 의해 알려지지 않은 총량으로 발현되지만 고정되고 알려진 상대적인 일대일의 양으로 발현됩니다. 다음 프로토콜은 1:1 프로브를 구성하는 방법과 FRET 효율의 정량화에 사용하는 방법을 설명합니다. 모든 공식이 포함된 스프레드시트는 부록에서 찾을 수 있으며 독자가 아래에 설명된 대로 각 열에 자신의 측정값을 입력하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜은 GFP-Cherry 기증자/수용체 쌍을 사용하지만 제시된 접근 방식은 다른 FRET 쌍으로 수행할 수 있습니다. 보충 파일 1 은 청록색-노란색 쌍에 대한 세부 정보를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clontech mCherry N1 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>3553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM without phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek 8-well chambers #1.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing protein interactions in live-cells with fret-sensitized emission

Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 여기된 기증자에서 수용체 분자로 에너지를 방사선 없이 전달하는 것이며 분자의 거리와 방향, 기증자 방출과 수용체 흡수 스펙트럼 사이의 겹침 정도에 따라 달라집니다. FRET를 사용하면 시간이 지남에 따라 살아있는 세포와 다른 세포 내 구획에서 단백질의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 현미경을 사용하여 FRET를 측정하는 다양한 강도 기반 알고리즘이 문헌에 설명되어 있습니다. 여기서, 수용체의 감작된 방출과 공여체 분자의 담금질 모두를 측정하여 FRET 효율을 정량화하기 위한 프로토콜과 알고리즘이 제공됩니다. 살아있는 세포에서 비율계량 FRET의 정량화는 형광 단백질의 누화(스펙트럼 유출 또는 블리드 스루)의 측정뿐만 아니라 현미경 설정의 검출 효율도 필요로 합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 이러한 중요한 매개 변수를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

도 1은 공여 채널, 채널 1 (488, 505-530 nm), 전달 채널 2 (488, >585 nm) 및 수용체 채널 채널 3 (561, >585 nm)에서 각각 획득된 이미지를 보여준다. GFP만 발현하는 세포, Cherry만 발현하는 세포, GFP와 Cherry를 동시에 발현하는 세포, GFP-Cherry 융합 단백질을 발현하는 세포의 대표 이미지. GFP-Cherry 융합 단백질을 발현하는 NRK 세포(양성 대조군, 그림 2A</s...

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Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

이 프로토콜은 기증자 담금질 및 수용체 감응 방출을 사용하여 FRET를 정량화하는 단계별 실험 프로세스 및 수학적 알고리즘을 설명합니다. 살아있는 세포에서 FRET 효율을 정량화하려면 형광 단백질의 누화와 현미경 설정에서 형광단의 상대적 방출 및 검출 효율을 결정해야 합니다. 누화는 단 하나의 형광단을 발현하는 이미징 세포에 의해 평가될 수 있습니다.공여체 또는 수용체 분자의 검출 효율을 평가하려면 측정 신호를 발생시키는 공여체 및 수용자 분자의 수의 비율에 대한 지식이 필요합니다. 살아있는 세포에서 발현되는 형광단의 수는 세포마다 다르며 알려져 있지 않습니다. 이 방법에 사용되는 일대일 공여체-수용체 융합 단백질인 교정 프로브를 사용하면 공여체 및 억셉터 분자의 상대적 검출 효율을 결정할 수 있습니다.먼저, EGFP mCherry 1 융합 프로브를 생성하기 위해 mCherry 1과 함께 N1 포유류 세포 발현 벡터를 사용합니다. 정지 코돈 없이 EGFP를 증폭하는 올리고뉴클레오티드를 세포일 BAM h1 단편으로 설계한다. 녹색 및 적색 형광 단백질 사이의 5개의 아미노산 링커는 0.25 내지 0.3의 GFP 체리 기증자-수용체 쌍에 대한 평균 FRET 결핍을 산출해야 한다.배경 형광을 줄이기 위해 페놀 레드가 없는 세포주와 배지를 사용하십시오. 세포가 80 % confluent가되면, 0.05 % trypsin EDTA의 1 밀리리터로 그들을 분리하고 5 밀리리터 세포 현탁액에서 3 방울을 첨가하여 8 웰 플레이트의 각 웰에 약 10, 000 개의 세포를 시드한다. 도금 24시간 후, 적절한 형질주입 배지를 사용하여 세포를 형질감염시킨다.적절한 형광 단백질 발현, 접힘 및 성숙을 허용하기 위해 생세포 이미징 전에 20시간 동안 세포를 배양합니다. 섭씨 37도의 가습 및 가열된 환경 챔버에서 컨포칼 스캐닝 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 생리학적 pH에서 세포 배지를 완충하려면 20밀리몰 HEPES를 추가하여 세포 배지를 이산화탄소와 독립적으로 만듭니다.그런 다음 슬라이드를 현미경에 장착합니다. 아르곤 이온 레이저의 488 나노 미터 라인을 사용하여 GFP를 자극하고 561 나노 미터 다이오드 레이저를 사용하여 체리를 자극합니다. 채널 1에서 505 - 530 나노미터의 방출 대역을 통해 여기용 488 나노미터 레이저를 설정하고 585 나노미터 이상의 롱 패스 필터를 사용하여 채널 2에서 여기합니다.585 나노미터 이상의 롱 패스 필터와 함께 채널 3의 여기를 위해 561 나노미터 레이저를 사용하십시오. 두 개의 레이저를 순차적으로 여기시키고 각 라인 이후에 전환되도록 이미징 모드를 설정하여 각 라인 다음에 512 x 512 픽셀 이미지의 여기가 번갈아 가도록 합니다. 3개 영상의 미니 시계열을 설정하여 상당한 광표백이 발생하는지 감지하고 필요한 경우 레이저 출력을 줄입니다.먼저, GFP 체리 융합 구조체를 발현하는 이미지 세포. 공초점 이미지에서 픽셀당 시간 통합 레이저 강도를 정의하는 파라미터를 설정합니다. 63X 오일 대물렌즈를 사용하고 줌을 3X로 설정하여 충분한 배율과 해상도로 셀 전체를 이미지화합니다.70-80 나노 미터의 픽셀 크기를 목표로합니다. 488 나노미터 및 561 나노미터 레이저의 경우 픽셀 체류 시간을 2-4마이크로초로 설정하고 AOTF 전송을 설정하여 이미지가 표백 없이 우수한 신호 대 잡음비를 표시하고 형광 강도 포화를 나타내는 픽셀이 없도록 합니다. 채널 1과 채널 3의 신호 레벨이 비슷하도록 488 및 561의 레이저 출력을 조정합니다.사진 배율 게인을 600에서 800으로 설정합니다. 이미지 15 내지 20은 GFP를 발현하는 세포, GFP, GFP 및 체리를 발현하는 세포, 및 비-형질전환된 세포이다. 그런 다음 GFP와 체리에 각각 결합된 관심 단백질을 공동 발현하는 이미지 세포.FRET를 계산하려면 채널 1, 488 나노미터 여기 및 505 내지 530 나노미터의 방출 대역을 갖는 도너 채널에서 도너 신호를 측정한다. 그런 다음 561 나노미터 여기와 585 나노미터 이상의 방출을 가진 수용체 채널인 채널 3에서 수용체 신호를 측정합니다. 마지막으로 488나노미터 여기와 585나노미터 이상에서 방출되는 전송 채널인 채널 2에서 FRET 신호를 측정합니다.채널 2의 신호는 4가지 다른 구성 요소의 합입니다: 담금질된 도너 신호에서 누화 계수 S1이 있는 585개 이상의 검출 채널로의 스펙트럼 파급, 누화 계수 S2가 있는 488나노미터 빛에 의한 직접 여기로부터의 수용체 신호, 여기된 기증자 분자에서 FRET에 의한 수용체의 감작된 방출, 그리고 배경 신호. 공여자 채널, 전달 채널 및 수용체 채널에서 이미지를 얻었으며, GFP 만 발현하는 세포, 체리 만, GFP 및 체리 공동 발현 및 GFP 체리 융합 단백질이 표시됩니다. GFP 체리 융합 단백질을 발현하는 NRK 세포와 GFP 체리를 공동 발현하는 NRK 세포에서 계산된 평균 세포 FRET 효율은 각 세포의 수용체 대 기증자 비율 강도 비율 또는 분자 비율에 대해 플롯됩니다.GFP 체리 융합 단백질을 발현하고, 음성 대조군으로 GFP와 체리를 공동 발현하고, Ashwell-Morell 수용체의 수용체 서브유닛을 발현하는 세포의 픽셀 단위로 정규화된 FRET 이미지가 여기에 표시됩니다. 쥐 간 렉틴의 RHL1 및 2는 원형질막의 세포질 쪽에 GFP 및 체리로 표지되었습니다. GFP RHL1 및 체리 RHL2 및 GFP RHL1 델타 스톡 및 체리 RHL2를 발현하는 세포의 평균 세포 FRET 효율은 수용체 대 기증자 분자 비율에 대해 표시됩니다.제시된 정량적 FRET 접근 방식은 다음을 허용합니다. 살아있는 세포의 생리학적 맥락에서 단백질 상호작용의 검출. 시간 경과에 따른 단백질 상호 작용의 변화.세포 내 구획의 상호 작용에서 공초점 이미지의 픽셀 수준별 차이. 및 살아있는 세포에서 발현되는 분자 수용체 대 공여체 비율에 대한 검출된 FRET 신호의 의존성.