Оценка белковых взаимодействий в живых клетках с FRET-сенсибилизированным излучением

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) представляет собой безрадиационный перенос энергии от возбужденного донора к акцепторной молекуле и зависит от расстояния и ориентации молекул, а также от степени перекрытия между спектрами донорского излучения и акцепторного поглощения. FRET позволяет изучать взаимодействие белков в живой клетке с течением времени и в различных субклеточных компартментах. В литературе описаны различные алгоритмы измерения FRET с помощью микроскопии, основанные на интенсивности. Здесь представлены протокол и алгоритм для количественной оценки эффективности FRET, основанные на измерении как сенсибилизированного излучения акцептора, так и гашения молекулы-донора. Количественная оценка ратиометрического FRET в живой клетке требует не только определения перекрестных помех (спектрального перелива или утечки) флуоресцентных белков, но и эффективности обнаружения микроскопической установки. В приведенном здесь протоколе подробно описано, как оценить эти критические параметры.