Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es la transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia y orientación de las moléculas, así como del grado de superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. FRET permite estudiar la interacción de proteínas en la célula viva a lo largo del tiempo y en diferentes compartimentos subcelulares. En la literatura se han descrito diferentes algoritmos basados en la intensidad para medir FRET utilizando microscopía. Aquí, se proporciona un protocolo y un algoritmo para cuantificar la eficiencia FRET basada en la medición tanto de la emisión sensibilizada del aceptor como del enfriamiento de la molécula donante. La cuantificación de FRET ratiométrico en la célula viva no solo requiere la determinación de la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes, sino también la eficiencia de detección de la configuración microscópica. El protocolo proporcionado aquí detalla cómo evaluar estos parámetros críticos.