Bedömning av proteininteraktioner i levande celler med FRET-sensibiliserad emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) är den strålningsfria överföringen av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och orientering samt graden av överlappning mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. FRET tillåter att studera interaktionen mellan proteiner i den levande cellen över tid och i olika subcellulära fack. Olika intensitetsbaserade algoritmer för att mäta FRET med mikroskopi har beskrivits i litteraturen. Här tillhandahålls ett protokoll och en algoritm för att kvantifiera FRET-effektivitet baserat på mätning av både acceptorns sensibiliserade emission och kylning av donatormolekylen. Kvantifieringen av ratiometrisk FRET i den levande cellen kräver inte bara bestämning av överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna utan också detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska inställningen. Protokollet som tillhandahålls här beskriver hur man bedömer dessa kritiska parametrar.