Abstract
Biology
Das clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas-System hat die Genom-Editierung in eukaryotischen Zellen demokratisiert und zur Entwicklung zahlreicher innovativer Anwendungen geführt. Die Abgabe des Cas9-Proteins und der Single-Guide-RNA (sgRNA) in Zielzellen kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen. Klassische virale Vektoren, wie sie von Lentiviren (LVs) oder Adeno-assoziierten Viren (AAVs) abgeleitet werden, ermöglichen eine effiziente Abgabe von Transgenen, die für das Cas9-Protein und die zugehörige sgRNA in vielen Primärzellen und in vivo kodieren. Dennoch können diese Vektoren nachteile wie die Integration des Transgens in das Zielzellgenom, eine begrenzte Ladekapazität und die langfristige Expression des Cas9-Proteins und der Guide-RNA in Zielzellen aufweisen.
Um einige dieser Probleme zu überwinden, wurde ein auf dem murinen Leukämievirus (MLV) basierender Verabreichungsvektor entwickelt, um das Cas9-Protein und die zugehörige Guide-RNA in Abwesenheit eines kodierenden Transgens zu verpacken. Durch die Verschmelzung des Cas9-Proteins mit dem C-Terminus des Strukturproteins Gag aus MLV wurden virusähnliche Partikel (VLPs) gebildet, die mit dem Cas9-Protein und sgRNA (genannt "Nanoblades") beladen waren. Nanoblades können aus dem Kulturmedium von Produzentenzellen gesammelt, gereinigt, quantifiziert und verwendet werden, um Zielzellen zu transduzieren und den aktiven Cas9 / sgRNA-Komplex abzugeben. Nanoblades liefern ihre Ribonukleoprotein (RNP) -Ladung vorübergehend und schnell in eine Vielzahl von primären und immortalisierten Zellen und können für andere Anwendungen programmiert werden, z. B. die vorübergehende transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen unter Verwendung modifizierter Cas9-Proteine. Nanoblades sind in der Lage, in vivo Genome-Editing in der Leber von injizierten erwachsenen Mäusen und in Eizellen zu bearbeiten, um transgene Tiere zu erzeugen. Schließlich können sie mit Donor-DNA für eine "transfektionsfreie" homologiegesteuerte Reparatur komplexiert werden. Die Nanoklingenpräparation ist einfach, relativ kostengünstig und kann problemlos in jedem zellbiologischen Labor durchgeführt werden.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved