Detta arbete med att utveckla detta protokoll stöddes av National Institutes of Health (R01-EB019453-02), kontoret för direktören för nationell intelligens, intelligens avancerade forskningsprojekt aktivitet genom Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency genom Texas A&M University (W911NF1920013), Fysiklaboratoriet (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). De åsikter och slutsatser som finns häri är författarnas och bör inte tolkas som att de nödvändigtvis representerar den officiella politiken, antingen uttryckt eller underförstådd, av ovanstående organisationer eller den amerikanska regeringen. Den amerikanska regeringen har rätt att reproducera och distribuera omtryck för statliga ändamål trots alla upphovsrättsanteckningar däri.

1. Beredning av hydrogelpartiklar för partikelmallad emulgering.
Hydrogelpartiklar som används för partikelmallad emulgering kan beredas med två olika metoder.
<ol><li>Beredning med kommersiellt tillgängliga partiklar
	<ol>
<li>Tillsätt 0,5 g torkade polyakrylamidpartiklar som är kompatibla med PTE (t.ex. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm diameter) till 30 ml sterilt vatten i ett koniskt rör på 50 ml och blanda väl. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Beredning med mikrofluidisk tillverkning av partiklar OBS: Polyakrylamidpartiklar som är kompatibla med PTE kan beredas med hjälp av kommersiellt tillgängliga dropptillverkare (t.ex. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) etc.), eller genom anpassad mikrofluidisk design.<ol><li>Tillverkning av anpassad mästare
		<ol>
<li>Designa en mjuk fotolitografimask med hjälp av CAD-programvara (Computer-Aided Design). Skriv ut fotomasken med en upplösning på 10 μm på kretskortsfilm.</li>
			<li>Häll 1 ml photoresist på mitten av en 3 i kiselskiva. Använd en spinnlack för att skapa ett 50 μm lager av fotoresist genom att snurra den vid 500 rpm i 30 sek följt av 1250 rpm i 30 sek. Placera skivan på en kokplatta som är inställd på 95 °C i 15 minuter för att avdunsta lösningsmedlet.</li>
			<li>Fäst fotomasken på kiselskivan med en omslagsglasrutschbana och exponera skivan under en kollimerad 190 mW, 365 μm UV LED i 2,5 min. Placera skivan på en kokplatta inställd på 95 °C i 5 minuter för bakning efter exponering.</li>
			<li>Utveckla fotoresist-kiselskivan genom att nedsänka den i ett bad av 100% propylenglykolmonetyleteracetat (PGMEA) i upp till 15 min. Skölj skivan med färsk 100% PGMEA följt av 100% isopropanol. Lufttorka waferen.</li>
			<li>Ta bort eventuell kvarvarande isopropanol genom att torka skivan på en kokplatta som är inställd på 95 °C i 1 min. Placera skivan i en ren 3 i Petri skål.</li>
		</ol></li>
		<li>Tillverkning av den anpassade mikrofluidiska enheten
		<ol>
<li>Blanda polydimethylsiloxan (PDMS) kiselbas och härdningsreagens i ett 10:1-förhållande i massa. Avgasa det blandade PDMS med hjälp av en desiccator under husvakuum tills inga luftbubblor kan observeras.</li>
			<li>Häll det avgasade PDMS över mästaren i petriskålen, så att kiselskivan är helt nedsänkt. Avgasa kiselskivan och PDMS för att avlägsna eventuella luftbubblor som kan ha bildats under hällningen.</li>
			<li>Härda PDMS genom att placera kiselskivan och PDMS i en ugn som är inställd på 65 °C i minst 60 minuter. Ta bort ett block av PDMS som innehåller de mikrofluidiska funktionerna från petriskålen med hjälp av en skalpell. Var extra försiktig för att undvika att skada några funktioner som finns på kiselmästaren.</li>
			<li>Stansa inloppen och utloppen i PDMS-blocket som motsvarar inloppen och utloppen i den mikrofluidiska enheten med hjälp av en 0,75 mm biopsistans. Avlägsna damm och partiklar med upprepad applicering och borttagning av förpackningstejp till ytan av PDMS-blocket.</li>
			<li>Rengör en 50 mm x 75 mm glasrutschbana genom att skölja den med 100% isopropanol och därefter lufttorka ytan. Plasma behandlar både glasrutschbanan och PDMS (funktioner vända uppåt) med 1 mbar O2-plasma i 1 minut med hjälp av en plasmabindning.</li>
			<li>Fäst PDMS på glasrutschbanan genom att placera det plasmabehandlade PDMS med funktioner vända nedåt på glasrutschbanan, plasmabehandlad sida vänd uppåt. Placera glidet i en ugnsuppsättning på 65 °C i minst 30 minuter för att slutföra bindningen.</li>
			<li>Behandla alla mikrofluidiska kanaler med en fluorerad ytbehandling för att säkerställa ythydrofobi och förhindravätning. Grädda apparaten vid 65 °C i minst 10 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Tillverkning av frestande partiklar
		<ol>
<li>Förbered en polyakrylamidlösning (PAA) bestående av 6,2% akrylamid, 0,18% N, N′-metylenebis (akrylamid) och 0,3% ammoniumpersulfat. Ladda denna lösning i en 1 ml spruta med en 28G nål.</li>
			<li>Förbered en olöslig kontinuerlig fas bestående av 5% (w/w) fluorosurfaktant och 1% N, N, NN-tetrametyllethylenediamine (TEMED) i fluorvätskeolja (HFE) för generering och stabilisering av droppar. Ladda lösningen i en ny 1 ml-spruta.</li>
			<li>Ladda både PAA- och HFE-lösningen som innehåller sprutor i sprutpumpar (t.ex. NE-501). Anslut båda sprutorna till den mikrofluidiska enheten med hjälp av polyetenrör som sätts in på sprutan och i enheten. Innan du ansluter, prime pumparna för att ta bort luften från slangen. OBS: Beroende på modell kan sprutpumpar styras med inbyggd ingång, tillverkningsprogram eller ett anpassat skript (finns på https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).</li>
			<li>Kör droppgenereringsanordningen med OLJEINgångarna PAA och HFE vid 300 μL/h respektive 500 μL/h. Samla 1 ml av dropparna i ett 15 ml uppsamlingsrör och inkubera i 3 h vid rumstemperatur för polymerisation. Efter inkubationen, ta bort det nedre lagret av olja genom pipettering.</li>
			<li>Tillsätt 1 ml 20% (v/v) perfluoro-1-oktanol (PFO) i HFE-olja till uppsamlingsröret på 15 ml som kemisk demulsifierare. Efter blandning, snurra ner 15 mL uppsamlingsröret vid 2000 x g i 2 min. Ta bort PFO/HFE-supernatanten genom pipettering. Upprepa 1x.</li>
			<li>Tillsätt 2 ml 2% sorbitanmonooleat i hexan till 15 ml uppsamlingsrör och virvel att blanda. Snurra röret vid 3000 x g i 3 min. Ta bort supernatanten genom pipettering för att avlägsna tensid/hexanlösning. Upprepa 2x.</li>
			<li>Tillsätt 5 ml TEBST-buffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) och blanda väl. Snurra ner på 3 000 x g i 3 min. Ta bort supernatanten genom pipettering. Upprepa 3x.</li>
			<li>Återanvänd i 5 mL TEBST. Denna lösning kan förvaras vid 4 °C på obestämd tid.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Partikelmallad emulgering.
Efter beredning av frestande partiklar används PTE för att kapsla in provet och reagenserna i droppar.
<ol><li>Förbered polyakrylamidpartiklarna för partikelmallad emulgering genom centrifugering vid 6000 x g i 1 min för att pelletera partiklarna, ta sedan bort supernatanten genom pipettering och återanvändning med sterilt vatten. Upprepa 3x för att säkerställa att eventuell kvarvarande TEBST tas bort.</li>
	<li>Bestäm koncentrationen och diametern på de frestande partiklarna med hjälp av en hemocytometer (eller motsvarande). Beräkna individuell partikeldiameter genom att mäta diametrar i pixlar och konvertera till mikron. Konvertering av pixlar till mikron kan beräknas med hjälp av hemocytometern (eller motsvarande) som kalibreringsbild och mätning av det kända rutnätsavståndet i pixlar.</li>
	<li>Förbered spridningsfasen i ett färskt 1,5 ml mikrocentrifugerör med hjälp av en PCR-huvudblandning, lämpliga primers och en fluoresceinhydrolyssond enligt tabell 1. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min under skonsam omrörning (10 varv/min) med hjälp av en rörrotator för att säkerställa homogen fördelning av komponenterna. OBS: Volymen och målkoncentrationen av partiklar baseras på Poisson-belastning. Som allmän regel bör antalet partiklar vara en storleksordning som är större än antalet prover som ska kapslas in. För prover av okända koncentrationer är en utspädningsserie nödvändig för att säkerställa Poisson-belastning.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Volym</td>
			<td>Reagens</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 μL</td>
			<td>Partiklar (450 partiklar / μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 μL</td>
			<td>2x PCR-huvudmix</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>10 μM framåt primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>10 μM omvänd primer</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 μL</td>
			<td>10 μM sond</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,8 μL</td>
			<td>Triton X100</td>
		</tr>
<tr>
<td>45.2 μL</td>
			<td>Nukleasfritt vatten</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Förberedelse av PCR-huvudmixen som används med PTE för digital dropp PCR.
<ol start="4"><li>Centrifugera spridningsfasen vid 6000 x g i 1 min och ta bort supernatanten. Registrera volymen av det extraherade supernatantmedlet och använd den totala dispersionsfasvolymen beräknad i 2.3 bestäm pelletvolymen. OBS: Mängden supernatant som extraheras varierar beroende på partikelförpackning, diameter och koncentration med en förväntad volym på minst 300 μL.</li>
	<li>Tillsätt 1 μL av 1,62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae genomiskt DNA till pelleten från 2.4 och blanda noggrant genom pipettering eller kraftig gängning. Obs: Förekomsten av överflödigt vattenhalt kan minska inkapslingseffektiviteten. Om provvolymen överstiger 1 % av pelletvolymen koncentrerar du provet. Om provet inte kan koncentreras skalar du PCR-huvudblandningen och den resulterande pelletsvolymen enligt provvolymen. PTE tillåter emulgering av små (10 μL) till stora (2 ml) volymer av frestande partiklar. PCR-huvudblandningen (2.3) och oljan (2.6) kan skalas enligt målet (2.3) respektive mätas (2.4) volymen av partikelpelleten.</li>
	<li>Tillsätt 200 μL 2% fluorokaktant i HFE-olja till röret som den olösliga kontinuerliga fasen för emulgering. Se till att pelleten lossnar genom pipettering eller gängning/snärtning av röret. Virvel vid 3000 varv/min i 30 sekunder. OBS: Inställningen motsvarande 3000 varv/min kan variera beroende på märke och modell.</li>
	<li>Låt emulsionerna bosätta sig i 1 min. Ta bort 100 μL av den nedre oljefasen och ersätt denna volym med färskt 2% fluorosurfaktant i HFE-olja. Vänd försiktigt röret flera gånger för att blanda. Upprepa 3-5x eller tills små satellitdroppar har tagits bort.</li>
</ol>3. Digital droplet PCR och analys.
<ol><li>Efter 2-5 minuters sedimentering, ta bort bottenoljefasen. Ersätt denna volym med 5 % fluorokaktant i fluorkarbonolja (t.ex. FC-40).</li>
	<li>Pipetterspets med hjälp av en bred rörettspets rörsätt försiktigt i 200 μL PCR-rör. Placera PCR-rören i en termocykel och kör enligt tabell 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Varaktighet</td>
			<td>Anteckningar</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>90 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upprepa x34 steg 2 till 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>hålla</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Termocykling villkor för digital droplet PCR med PTE emulsioner.
<ol start="3"><li>Pipettera provet på en räknebild med hjälp av en bred rörettspets för fluorescerande avbildning. Avbilda provet med ett fluorescerande mikroskop med 490 nm excitation och 525 nm emissionsdetekteringsvåglängder.</li>
	<li>Kvantifiera de positiva fluorescerande dropparna (Np) och totala droppar (NT) för att verifiera närvaron och beräkna antalet mallmolekyler (λ) med hjälp av fraktionen av positiva droppar (Np/NT) och Poisson statistik: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq01.jpg">
</li>
	<li>Beräkna konfidensintervallet på 95 % (zc = 1,96) med: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq02.jpg">
</li>
	<li>Beräkna provkoncentrationen (molekyler/μL) med hjälp av volymen (ν i μL) av provet som tillsatts i steg 2.5, med hjälp av ekvationen nedan. Bestäm medelvärdet och standardavvikelsen för provkoncentrationen med hjälp av tekniska replikat. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62248/62248eq03.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics:+A+tool+for+biology,+chemistry,+and+nanotechnology.">Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology.</a> Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li><li>Gielen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput-directed+enzyme+evolution+by+absorbance-activated+droplet+sorting+(AADS).">Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).</li><li>Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+genome-wide+studies+involving+next+generation+sequencing.">Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing.</a> Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).</li><li>Olmedillas-L&#243;pez, S., Garc&#237;a-Arranz, M., Garc&#237;a-Olmo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+Applications+of+Droplet+Digital+PCR+in+Oncology.">Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).</li><li>Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Digital+PCR+in+Detecting+Human+Diseases+Associated+Gene+Mutation.">Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+droplet+digital+PCR+for+non-invasive+prenatal+diagnosis+of+phenylketonuria.">Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).</li><li>Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Droplet+Microfluidics.">Emerging Droplet Microfluidics.</a> Chemical Reviews. 117 (12), 7964-8040 (2017).</li><li>The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9, 541-544 (2012).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).</li><li>Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Templated+Emulsification+for+Microfluidics-Free+Digital+Biology.">Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology.</a> Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).</li><li>Panda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop-flow+lithography+to+generate+cell-laden+microgel+particles.">Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles.</a> Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).</li><li>Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+microparticle-based+system+for+pooled+assays+of+small+molecules+in+cellular+contexts.">Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).</li></ol>

Författare har inget att avslöja.

PTE använder partiklar för att kapsla in prover i monodisperserade droppar genom virvel. Förutom sin enkelhet och tillgänglighet ger PTE flera ytterligare fördelar, inklusive att låta stora volymer droppar genereras omedelbart. Dessutom kan processen utföras i ett isolerat rör, vilket undanröjer behovet av att överföra prover till mikrofluidiska enheter, effektivisera det övergripande arbetsflödet och begränsa möjligheterna till provkontaminering eller förlust. De frestande partiklarna ger också ett sätt att konstruera innehållet i de resulterande droppreaktionerna. Till exempel kan partikelstorlek, kemi och vätbarhet konstrueras för riktad biomolekyl eller cellfångst, medan funktionella moieties som enzymer, aktiva eller nukleinsyror kan visas på partikel för att underlätta reaktioner, till exempel för encellssekvensering eller funktionell karakterisering. Även om tillvägagångssättet är flexibelt finns det ändå viktiga begränsningar för dess användning. Det är till exempel för närvarande inte möjligt att utföra dropptillskott som ofta utförs med mikrofluidik, vilket kräver att alla reaktionskomponenter införs före inkapsling. Detta kräver att reagenser är kompatibla och stabila tills dropparna kan genereras och, när det gäller besvärliga kombinationer, ofta kan åtgärdas genom att snabbt blanda och emulgera provet på is. Alternativt kan reaktiva komponenter som kan utlösas externt med ljus eller värme användas13. PTE ger därmed en flexibel och skalbar metod för att genomföra droppanalyser som är tillgängliga för icke-experter. Detta, i kombination med dess medfödda enkelhet och flexibilitet, gör PTE idealiskt för utförande och utveckling av många droppapplikationer.

Droplet mikrofluidik utnyttjar compartmentalization i picoliter droppar för att öka känsligheten och noggrannheten i analyser jämfört med bulkreaktioner, och har många tillämpningar inom kemisk screening, proteinteknik, och nästa generations sekvensering1,2,3. Till exempel ger digital dropppolymeraskedjereaktion (ddPCR) ökad noggrannhet jämfört med bulk kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), med tillämpningar för genetisk variation i cancer, påvisande av sjukdomar som orsakar mutationer och prenatal diagnostik4,5,6. En utmaning med droppmikrofluidik är dock kravet på mikrofluidiska anordningar för att dela prover. medan mikrofluidik ger utmärkt kontroll över droppegenskaper, kräver de specialiserad expertis för att bygga och driva7,8. Följaktligen är droppbaserade metoder till stor del begränsade till expertlaboratorier eller, i sällsynta fall, applikationer där ett kommersiellt instrument finns tillgängligt9,10. För att bredda användningen av droppanalyser är kravet på specialiserad mikrofluidisk instrumentering ett hinder som måste övervinnas.
I den här artikeln beskriver vi Particle Templated Emulsification (PTE), en mikrofluidisk-fri metod för att utföra reaktioner i monodispersed droppar. I PTE slukar frestande partiklar provet till droppar i bärarolja genom enkel virvel (figur 1). När systemet blandas fragmenterar vattendelen i droppar av reducerande storlek tills dropparna innehåller enstaka partiklar, då ytterligare fragmentering inte är möjlig eftersom det kräver att partiklarna bryts. Det uppslukade provet omger partiklarna som ett skal i dropparna och kapslar därmed in spridda celler, reagenser eller funktionella munterier (figur 1D). PTE kräver således ingen utrustning eller expertis för att utföra droppreaktioner utöver en vanlig virvel. Dessutom tar droppgenerering sekunder jämfört med minuter eller timmar med mikrofluidik, och mängden som produceras är proportionell mot behållarens volym, inte enhetens driftstid, vilket gör den ytterst skalbar. Dessa fördelar gör PTE idealisk för att genomföra droppanalyser under en mängd olika omständigheter där mikrofluidik är opraktiska. Här demonstrerar vi PTE och använder den för att utföra ddPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig01.jpg"> Figur 1. Översikt över partikelmallad emulgeringsprocess. A) Templatingpartiklar blandas med reagenser. B) Överskott av reagenser avlägsnas efter centrifugering. (C) Tillsats av mallmolekyler sker före tillsats av olja. D) Virveling producerar droppar som innehåller en enda mallmolekyl. (E) Efterföljande termocykling och avbildning möjliggör digital droppanalys av målmallen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm biopsy punch</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>370533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gauge needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-printed centrifuge syringe holder</td>
			<td>(custom)</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel (fluorinated surface treatment)</td>
			<td>Pittsburgh Glass Works</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>139386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-40 fluorinated oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil)</td>
			<td>3M</td>
			<td colspan="2">98-0212-2928-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorosurfactant</td>
			<td>Ran Biotechnologies</td>
			<td colspan="2">008-FluoroSurfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA developer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td>(custom)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Specialty Coating Systems</td>
			<td>G3P-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80 (sorbitane monooleate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s6760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 photoresist</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>17030192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>t8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4464263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast FWD</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast REV</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA 
			AC-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Probe</td>
			<td>IDT</td>
			<td colspan="2">5&#8242;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk 
			FQ/-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS LED Cube, GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;AMEP4651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)</td>
			<td>&#160;Dow Corning</td>
			<td>DC4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae genomic DNA</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>69240-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded plasma cleaner (plasma bonder)</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td colspan="2">PDC-002 (230V)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

particle templated emulsification enables microfluidic-free droplet assays

Reaktioner som utförs i monodispersed droppar ger förbättrad noggrannhet och känslighet jämfört med motsvarande som utförs i bulk. Kravet på mikrofluidik för att bilda kontrollerade droppar utgör dock ett hinder för icke-experter, vilket begränsar deras användning. Här beskriver vi partikelmallad emulgering, ett tillvägagångssätt för att generera monodisperse droppar utan mikrofluidik. Med hjälp av frestande hydrogelsfärer kapslar vi in prover i monodisperserade droppar genom enkel virvel. Vi demonstrerar tillvägagångssättet genom att använda det för att utföra mikrofluidisk-fri digital PCR.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig02.jpg"> Figur 2. Inkapsling av prov i droppar med hjälp av partikelmallad emulgering. A) frestande partiklar som används för partikeltemperaturering av emulgering. B) Separation av frestande partikelpellet från supernatant efter centrifugering. C) Droppar till följd av partikelmallad emulgering med D) identifierbart vattenskal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
I PTE dikteras emulsionernas monodispersitet av de frestande partiklarna, eftersom dropparna har en diameter som är något större än partiklarna. Således är enhetliga partiklar centrala för kontrollerad PTE-inkapsling11. Det finns en mängd olika metoder för att generera enhetliga frestande partiklar, inklusive kemiska (solgel, emulsionspolymerisering), hydrodynamisk (membranemulgering, homogenisering) och filtreringsmetoder. Mikrofluidiska metoder ger i synnerhet utmärkt monodispersitet (figur 2A) och gör det möjligt för ytterligare partikelteknik att förbättra deras funktionalitet i PTE12. Alternativt kan frestande partiklar köpas, även om deras enhetlighet, även om de är tillräckliga, vanligtvis är mindre än med mikrofluidisk generation11.
För att utföra PTE blandas partiklarna med det prov som ska kapslas in (figur 1A), och överskottet av supernatant avlägsnas genom centrifugering och pipettering (figur 1B), vilket illustreras av ett fotografi av en partikelpellet längst ner på ett PCR-rör (figur 2B). Den inkapslande oljan som innehåller ett stabiliserande tensid tillsätts sedan (figur 1C), och provet pipetteras försiktigt innan det virvlar i 30 sekunder (figur 1D), för att generera emulsionen (figur 2C). De resulterande dropparna innehåller en partikelkärna och vattenskal som består av det ursprungliga provet, inom vilket reagenserna, målmolekylerna och cellerna som är nödvändiga för reaktionen (figur 2D). Precis som i droppmikrofluidisk inkapsling, diskreta enheter som små pärlor eller celler kapslas in slumpmässigt och i enlighet med en Poisson-fördelning, även om nästan alla droppar innehåller en frestande partikel på grund av PTE-fysikens natur.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig03.jpg"> Figur 3. Identifiering och rensning av partikelmallade emulgeringsdroppar. (A) Exempel på ojämn droppgenerering med flera partiklar per droppe från otillräcklig virvel. B) Förväntad förekomst av satelliter och droppar efter partikelmallad emulgering och C) bevattnad-i-olja-fraktionering. D) Resulterande emulsion efter oljetvätt. E) Överdriven satellitproduktion till följd av rest supernatant under partikelmallerad emulgering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Även i framgångsrika PTE, dubbel eller trippel kärna droppar finns, även om de i allmänhet bidrar försumbart till reaktionen, förutsatt att de är sällsynta. För att uppnå en låg frekvens av multicore droppar samtidigt som lämpliga skal behålls krävs optimering av processparametrar, inklusive ytspänning, interpartikel vidhäftningskrafter, provviskositet, behållarstorlek och virvelkraft och tid. Till exempel kan en dåligt optimerad emulgering innehålla polydisperserade droppar med många frestande partiklar (figur 3A), vilket indikerar att virveln var otillräcklig för att helt emulgera provet. I sådana fall kan tvättmedel tillsättas för att minska vidhäftning mellan partiklar och lägre ytspänning, eller virvelkraft eller tid kan ökas. En annan vanlig fråga är generering av överdrivna satelliter, som är små tomma droppar (figur 3B). Satelliter kan vara oundvikliga i PTE emulsioner beroende på den interfacial spänningen och reologiska egenskaper hos provet och bäraroljan. De är dock ofta resultatet av att överflödigt prov avlägsnas från emulgering (figur 2B) eller virvlar med för mycket kraft och tar bort skalen från dropparna. Vid en lyckad PTE-emulgering bör satelliterna inte utgöra mer än ~10 % av den totala inkapslade provvolymen (figur 3C)11. På denna nivå bidrar de vanligtvis försumbart till reaktionen och kan ignoreras. För estetiska ändamål kan de rensas från emulsionen genom att tvätta med färsk olja (figur 3D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig04.jpg"> Figur 4. Utvärdering av partikel mallad emulgering digital droppe PCR. (A) Fluorescerande avbildning av dropparna identifierar positiva fluorescerande droppar och negativa icke-fluorescerande droppar. (B) Identifiering av sällsynta mallar eller låga koncentrationer av mall med digital dropp PCR. (C) Över riklig mallinkapsling som resulterar i ett varierande antal mallmolekyler per droppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
För att demonstrera nyttan med PTE använde vi den för att utföra mikrofluidfri digital PCR11. Med hjälp av processen kapslade vi in ett prov bestående av S. cerevisiae genomiskt DNA och termocycled det. I digital PCR blir droppar som innehåller förstärkta mål fluorescerande, medan de utan förblir dim. En fluorescerande droppe indikerar således ett mål som möjliggör direkt mängd mål genom att räkna positiva droppar (figur 4A). Antalet fluorescerande droppar skalas alltså med målmolekylerna, vilket ger få positiva resultat när målet är sällsynt (figur 4B) och många när det är rikligt (figur 4C). Precis som vid inkapsling av andra diskreta komponenter följer målinkapslingen en Poisson-fördelning, vilket gör att den positiva droppfraktionen kan omvandlas till målkoncentrationen (figur 4D), vilket visar förmågan att utföra digital PCR med PTE11.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2.jpg"> Figur 5. Demonstration av digital droplet PCR med hjälp av kommersiellt tillgänglig PAA. A) Fluorescerande avbildning av dropparna identifierar negativa icke-fluorescerande droppar. B) Identifiering av låga koncentrationer av mall med digital dropp PCR. C) Identifiering av höga koncentrationer av mall med digital dropp PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/62248fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Dessa resultat är repeterbara med hjälp av kommersiellt tillgängliga polyakrylamidpartiklar (figur 5) och visar PTE:s förmåga att utföra standard digital PCR med kommersiellt tillgängliga polyakrylamidpartiklar, vilket ger exakta mätningar över samma intervall.
Kompletterande fil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62248/S1.tif" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays at JoVE.com

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Vatten-i-olja droppanalyser är användbara för analytisk kemi, enzymutveckling och encellsanalys, men kräver vanligtvis mikrofluidik för att bilda dropparna. Här beskriver vi partikel mallad emulgering, en mikrofluidisk-fri strategi för att utföra droppanalyser.

Partikelmallad emulgering möjliggör mikrofluidfria dropletanalyser

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Digital droplet PCR ger förbättrad noggrannhet och känslighet jämfört med kvantitativ PCR. Detta är en enkel metod för digital dropp PCR som kräver minimal utrustning och ingen expertis. Partikelmallad emulgering är en mikrofluidisk-fri metod för emulgering som inte kräver någon specialiserad utrustning.Dessutom sker emulgering under en period av sekunder och skalar till behållarvolymen. För kommersiella pärlor, tillsätt 0,5 gram torkade polyakrylamidpartiklar som är kompatibla med partikelmall emulgering, eller PTE, till 30 milliliter sterilt vatten i ett 50-milliliter koniskt rör och blanda väl. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.För mikrofluidisk tillverkning av pärlor, häll en milliliter fotoresist på mitten av en tre-tums kiselskiva och snurra den sedan vid 500 RPM i 30 sekunder, följt av 1250 RPM i 30 sekunder. Placera skivan på en kokplatta som är inställd på 95 grader Celsius i 15 minuter för att avdunsta lösningsmedlet. Fäst fotomasken på kiselskivan med en omslagsglasrutschbana och exponera skivan under en kollimerad UV-LED i 2,5 minuter.Placera skivan på en kokplatta inställd på 95 grader Celsius i fem minuter för bakning efter exponering. Utveckla den fotoresistiska kiselskivan genom att nedsänka den i ett bad på 100% PGMEA i upp till 15 minuter. Skölj skivan med färska 100% PGMEA, följt av 100% isopropanol.Lufttorka skivan, torka den sedan på en kokplatta inställd på 95 grader Celsius i en minut och placera den i en ren tre tums Petri-maträtt. Blanda PDMS kiselbas och härdningsreagens i ett 10:1-förhållande, Avgasa sedan det blandade PDMS med en desiccator under vakuum tills inga luftbubblor kan observeras. Häll det avgasade PDMS i Petri-skålen och se till att kiselskivan är helt nedsänkt.Degasera kiselskivan och PDMS och härda sedan PDMS genom att placera kiselskivan i en ugn som är inställd på 65 grader Celsius i minst 60 minuter. Punktskatt ett block av PDMS som innehåller de mikrofluidiska funktionerna från Petri-skålen, med hjälp av en skalpell. Stansa inloppen och utloppen i PDMS-blocket med en 0,75 millimeters biopsistans.Ta sedan bort damm och partiklar med upprepad applicering och borttagning av förpackningstejp till blockytan. Rengör en glasrutschbana genom att skölja den med 100% isopropanol och därefter lufttorka ytan. Plasma behandlar både glasrutschbanan och PDMS med en millibar syreplasma i en minut med hjälp av en plasmabindning.Fäst PDMS på glasrutschbanan genom att placera det plasmabehandlade PDMS med funktioner som vetter nedåt på glasrutschbanan, plasmabehandlad sida vänd uppåt. Placera rutschkanan i en ugnsuppsättning på 65 grader Celsius i minst 30 minuter för att slutföra bindningen. Behandla alla mikrofluidiska kanaler med en fluorerad ytbehandling för att säkerställa ythydrofobi och grädda sedan enheten vid 65 grader Celsius i minst 10 minuter.Ladda både polyakrylamid, eller PAA, och fluorvätske, eller HFE, lösningsinnehållande sprutor i sprutpumpar. Anslut båda sprutorna till den mikrofluidiska enheten med hjälp av polyetenrör. Kör droppgenereringsenheten och samla en milliliter av dropparna i ett 15-milliliter uppsamlingsrör och inkubera sedan i tre timmar vid rumstemperatur för polymerisation.Efter inkubationen, ta bort det nedre lagret av olja genom pipettering. Tillsätt en milliliter 20%PFO i HFE-olja till uppsamlingsröret på 15 milliliter som kemisk demulsifierare. Efter blandning, snurra ner uppsamlingsröret på 15 milliliter vid 2000 x g i två minuter.Ta bort det nedre lagret genom pipettering och upprepa processen en gång till. Tillsätt två milliliter 2% sorbitanmonolat i hexan till uppsamlingsröret på 15 milliliter och virvla det. Snurra röret på 3000 x g i tre minuter och ta bort supernatanten genom pipettering för att ta bort tensidlösningen.Upprepa detta två gånger. Tillsätt fem milliliter TEBST-buffert och blanda väl, snurra sedan ner vid 3000 x g i tre minuter och ta bort supernatanten genom pipettering. Upprepa detta tre gånger och återanvänd sedan i fem milliliter TEBST.Förbered polyakrylamidpartiklarna för partikelmallad emulgering genom centrifugering vid 6000 x g i en minut för att pelletera partiklarna. Ta sedan bort supernatanten genom pipettering och återanvänd pelleten i sterilt vatten. Upprepa tre gånger för att säkerställa att eventuell kvarvarande TEBST tas bort.Förbered spridningsfasen i ett nytt 15-milliliter centrifugrör, med hjälp av en PCR-huvudblandning, lämpliga primers och en fluoresceinhydrolysprob, enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Inkubera vid rumstemperatur i fem minuter under mild omrörning med hjälp av en rörrotator. Centrifugera spridningsfasen vid 6000 x g i en minut och ta bort supernatanten.Tillsätt en mikroliter saccharomyces cerevisiae genomiskt DNA till pelleten och blanda noggrant genom pipettering eller kraftig gängning. Tillsätt 200 mikroliter av 2% fluorosurfaktant i HFE-olja till röret, för emulgering. Lossa pelleten genom att pipettera eller knacka på röret och virvla sedan vid 3000 RPM i 30 sekunder.Låt emulsionerna sätta sig i en minut, ta sedan bort 100 mikroliter av bottenoljefasen och ersätt denna volym med färsk 2% fluorosurfaktant i HFE-olja. Vänd försiktigt röret flera gånger för att blanda. Upprepa detta tre gånger eller mer tills små satellitdroppar tas bort.Efter två till fem minuters avveckling, ta bort bottenoljefasen. Ersätt denna volym med 5% fluorosurfaktant i fluorkarbonolja. Pipettera 100 mikroliter prov i 200 mikroliter PCR-rör och placera PCR-rören i en termocykel.Pipettera provet på en räknebild för fluorescerande avbildning och avbilda provet. Partikelmallad emulgering ger utmärkt monodispersitet. När överskottet av supernatant avlägsnas stabiliserande tensid tillsätts, och provet virvlas för att generera emulsionen.De resulterande dropparna består av partikelkärna och vattenprov som innehåller reagenser och provmolekyler eller celler som är nödvändiga för reaktionen. Polydispersed droppar med frestande partiklar indikerar otillräcklig virvel. En annan fråga är generering av överdrivna satelliter, vilket minskar inkapslingseffektiviteten.Satelliterna bör inte utgöra mer än 10 % av den totala inkapslade provvolymen. De kan rensas från emulsionen genom att tvätta med färsk olja. Nyttan av PTE kan demonstreras i digital PCR när droppar som innehåller förstärkta mål blir fluorescerande, vilket möjliggör direkt mängd mål.De fluorescerande dropparna ger få positiva resultat när målet är sällsynt, och många när det är rikligt. Dessa resultat är repeterbara med hjälp av kommersiellt tillgängliga polyakrylamidpartiklar, vilket uppnår exakta mätningar över samma intervall. Avlägsnandet av supernatant från spridningsfasen är viktigt för provinkapsling.Att känna till pelletens och supernatantens volym kan hjälpa till att identifiera gränssnittet mellan de två. Om du är osäker, fela på sidan av att ta bort supernatanten.