Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Actin, o principal componente do citoesqueleto, desempenha um papel crítico na manutenção da estrutura e função neuronal. Nos estados fisiológicos, a actina ocorre em equilíbrio em suas duas formas: globular monomérica (G-actin) e fisordenos polimerizados (F- actina). Nos terminais sinápticos, o citoesqueleto de actin forma a base para funções críticas pré e pós-sináptica. Além disso, mudanças dinâmicas no status de polimerização da actina (interconversão entre formas globulares e relacionáveis de actina) estão intimamente ligadas a alterações relacionadas à plasticidade na estrutura e função sináptica. Informamos aqui uma metodologia baseada em fluorescência modificada para avaliar o status de polimerização da actina em condições ex vivo. O ensaio emprega fábulina fluorescentemente rotulada, uma falotoxina que se liga especificamente aos filamentos de actina (F-actin), fornecendo uma medida direta de ato de fiomatos polimerizados. Como prova de princípio, fornecemos evidências para a adequação do ensaio tanto em roedores quanto em homogeneizações de tecido cerebral humano pós-morte. Utilizando latrunculin A (uma droga que despomeriza filamentos de actina), confirmamos a utilidade do ensaio no monitoramento de alterações nos níveis de F-actin. Além disso, estendemos o ensaio a frações bioquímicas de terminais sinápticos isolados em que confirmamos o aumento da polimerização da actina após a estimulação por despolarização com alto K⁺extracelular .