Este proyecto ha recibido financiación del proyecto iNEXT-Discovery Horizonte 2020 de la Comisión Europea. I.M. Dobbie reconoce la financiación del Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Este trabajo se llevó a cabo con el apoyo de la Fuente de Luz Diamante, instrumento B24 (propuesta BI25512). Nuestro agradecimiento al personal de Micron y a todos nuestros excelentes usuarios y colaboradores por ayudarnos a establecer la crioSIM y su potencial correlativo.

<ol>
	<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy.">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).</li><li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway.">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+structured+illumination+microscopy.">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).</li><li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSIM:+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging.">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802 (2020).</li><li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy.">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583 (2018).</li><li>Kaufmann, R., Hagen, C., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+cryo-microscopy:+current+challenges+and+prospects.">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li><li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation:+a+web+application,+javascript+library,+and+data+resource.">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).</li><li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy.">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li></ol>

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

La SIM 3D a temperaturas criogénicas tiene muchas ventajas sobre otras técnicas de imagen SR para obtener imágenes de material biológico vitrificado. Requiere significativamente menos imágenes por rebanada z en comparación con otros métodos de SR, lo que resulta en menos irradiación y una menor probabilidad de formación de cristales de hielo para muestras vitrificadas. También es capaz de obtener imágenes de células enteras y se puede correlacionar con la tomografía de rayos X para hacer coincidir la estructura con la función. Curiosamente, la mayoría de los fluoróforos y etiquetas de fluorescencia disponibles comercialmente se blanquean menos en condiciones criogénicas que a temperatura ambiente. Sin embargo, dado el alto rendimiento cuántico de los fluoróforos más comunes a temperatura ambiente (más del 80% en algunos casos), la ganancia absoluta detectada en los fotones no se debe a cambios en el rendimiento cuántico, sino a una reducción en los complejos procesos de blanqueo. Más información sobre el rendimiento de los fluoróforos a temperaturas criogénicas se puede encontrar en 8.
Es fundamental que las muestras que llegan a la crioSIM hayan sido preaplicadas utilizando un microscopio de criofluorescencia convencional con capacidad de campo brillante para producir un "mapa" de cuadrícula que incluya el resaltado de todas las AOI potenciales para obtener imágenes adicionales(Figura 5). El tiempo de acceso en la crioSIM se asigna a través de un proceso competitivo que implica la presentación de una propuesta, que posteriormente se evalúa para determinar la viabilidad de la técnica y el impacto biomédico. El tiempo en el equipo, por lo tanto, siempre es "escaso", y las redes premaptadas permiten el uso más eficiente de una asignación. También es esencial que la muestra se mantenga vitrificada, especialmente durante la transferencia de la muestra desde el soporte de la muestra a la plataforma de imágenes, para minimizar la formación de cristales de hielo y el daño posterior de la muestra. La muestra debe ser de buena calidad para producir las mejores imágenes SIM. Una muestra bien preparada se caracterizará por las siguientes características: (a) no tendrá contaminación por cristal de hielo, (b) la rejilla utilizada será una rejilla de búsqueda, (c) el portador será plano, (d) la malla de la rejilla y la superficie del sustrato no serán auto-fluorescentes, y (e) no habrá roturas en la membrana de soporte. Estos requisitos previos se pueden lograr mediante un manejo cuidadoso de las muestras y asegurando que las muestras siempre permanezcan vitrificadas.
Es importante verificar de antemano si los fluoróforos de muestra propuestos darán suficiente señal en el microscopio crioSIM. Herramientas como SPEKCheck9 pueden ayudar a elegir las combinaciones óptimas de fluoróforos y filtros. Si hay problemas con la recopilación de datos sin procesar o el proceso de reconstrucción, los artefactos pueden aparecer en las imágenes después de la reconstrucción. Ejemplos de varios artefactos han sido documentados por Demmerle et al.10 Los parámetros de reconstrucción de imagen se pueden revisar en el archivo de registro de SoftWoRx si la reconstrucción no es óptima abriendo el archivo de resumen de reconstrucción. Debe haber un interlineado consistente a través de ángulos en un canal dado y una amplitud relativamente consistente. La variación de más del 30% y los valores significativamente superiores a 1 (si se aplica la compensación del tamaño de la perla) deben investigarse más de cerca y es probable que indiquen reconstrucciones fallidas. Además, el software SIMcheck2 en Fiji también se puede utilizar para realizar varias comprobaciones de los datos en bruto y reconstruidos para diagnosticar la causa de los errores en la configuración de los parámetros de imagen o reconstrucción. SIM-check y su mapa de contraste de modulación también pueden ayudar en la evaluación de la calidad de los datos reconstruidos al interpretar qué áreas de una imagen probablemente sean estructuras reales frente a artefactos.
El bajo contraste de modulación (mostrado por el color oscuro, en la Figura 5E)dentro del área nuclear significa que esta región va a ser más susceptible a los artefactos de reconstrucción, lo que implica que los patrones hash mostrados en el núcleo podrían clasificarse(Figura 5D)como un artefacto. Es más probable que las áreas de señal de fluorescencia fuertes reflejen con precisión las estructuras nativas en los datos procesados. En áreas de señal débil donde los fluoróforos se distribuyen en áreas más amplias, como la superficie total de una vesícula, es probable que la señal real coexista con los artefactos de procesamiento, y se debe tener cuidado en la interpretación de esos datos. Después de la inspección de los datos reconstruidos de rango completo para garantizar que no haya artefactos extraños, y que el fondo sea generalmente gaussiano y centrado cerca de cero, los datos generalmente se recortan a cero, o el valor modal, el pico de la señal de fondo, debería estar muy cerca de cero. Esto garantiza que el rango dinámico de la imagen mostrada no esté dominado por artefactos de fondo negativos. Cuando se espera una señal más débil, se debe tener especial cuidado al analizar las características y asegurarse de que sean estructuras reales en lugar de artefactos de reconstrucción.
Existen algunas limitaciones del sistema de imágenes. Debido a que la etapa de muestra es plana, las muestras con espesor variable o rejillas que no son planas no son sujetos ideales para la obtención de imágenes. Además, si las imágenes correlativas se realizarán utilizando tomografía de rayos X suave, las células cerca de los límites de la cuadrícula no deben ser fotografiadas, ya que no serán visibles en el microscopio de rayos X durante la adquisición de la serie de inclinación. Finalmente, la cantidad de borrado de la muestra antes de la congelación por inmersión tiene un impacto significativo en la calidad de la imagen; muy poca sección da como resultado muestras demasiado gruesas, lo que proporciona imágenes SIM subóptimas con un alto ruido de fondo, mientras que demasiada secreción puede hacer que las células se desforman y, por lo tanto, sean más susceptibles al daño por calor del rayo láser incidente. En resumen, cryoSIM es una poderosa herramienta de microscopía de fluorescencia para obtener imágenes de muestras biológicas en 3D en una etapa casi nativa y tiene una amplia gama de aplicaciones en muchas áreas.

Las técnicas de imagen SR se han vuelto ampliamente accesibles para los biólogos en la última década1. Permiten imágenes de alta resolución de muestras marcadas fluorescentemente más allá del límite de difracción. Sin embargo, ha sido difícil adaptar los métodos de microscopía SR para trabajar con muestras a temperaturas criogénicas2. Esto sería ventajoso para las imágenes correlativas en combinación con la tomografía electrónica o de rayos X. Recientemente, SIM se ha adaptado para su uso con muestras criogénicas y se ha demostrado con éxito que permite estudios correlativos de células biológicas junto con la tomografía de rayos X suave (SXT)3 en la línea de haz de crio-imagen correlativa B24 en el Sincrotrón diamond light source (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM puede duplicar la resolución de la microscopía convencional de campo amplio iluminando la muestra con patrones de luz rayados (flecos de Moiré) en tres ángulos y en cinco fases. La interferencia entre estos patrones de luz y la fluorescencia de la muestra se puede utilizar para descubrir computacionalmente información adicional sobre estructuras de subdiffracción4,5.
Hay varias ventajas de SIM sobre otras técnicas de SR para aplicaciones criogénicas. Primero, puede funcionar sin fluoróforos parpadeantes especialmente diseñados; se pueden utilizar fluoróforos convencionales, dando acceso a una gama más amplia de posibles agentes de marcado fluorescente6. Además, solo requiere 15 imágenes por rebanada z (en 3D; 9 imágenes para 2D), mientras que otros métodos SR toman aproximadamente 1000 imágenes por rebanada, lo que aumenta la posibilidad de que la muestra se caliente y, por lo tanto, aumenta el riesgo de formación de cristales de hielo, lo que puede causar artefactos. Finalmente, esta técnica puede obtener imágenes de muestras biológicas más gruesas de más de 10 μm, lo que permite obtener imágenes de células enteras en su estado casi nativo6. La crioSIM se ha construido utilizando componentes ópticos estándar y con software de acceso abierto para imágenes, lo que facilita la documentación y el duplicado si se desea6. La crioSIM tiene un objetivo de apertura numérica de 100x/0.9 (ver la Tabla de Materiales); Phillips et al.6 Aquí, este protocolo demuestra cómo usar el microscopio crioSIM, incluida la forma de cargar y descargar muestra muestras en la etapa criogénica, cómo recopilar datos en el microscopio y cómo reconstruir las imágenes SIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auto grids</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCT142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockpit Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo compatible polyurethane container</td>
			<td>Jena bioscience</td>
			<td>CC-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo TEM grid storage box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model#AutoGrid</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-SIM microscope</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made, see following reference for the design:&#160; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, &#34;CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging,&#34; Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostage system</td>
			<td>Linkam Scientific Instruments</td>
			<td>CMS196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python Microscope Software</td>
			<td>Oxford University</td>
			<td></td>
			<td>https://www.python-microscope.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific dry paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark 7551</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Reconstruction Software</td>
			<td>softWoRx, GE Healthcare</td>
			<td>Version&#160; 6.5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StitchM Software</td>
			<td>Diamond Light Source</td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids for samples</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools</td>
			<td>G200F1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) tridimensional (3D) permite obtener imágenes de estructuras celulares etiquetadas fluorescentemente a una resolución más alta que la microscopía de fluorescencia convencional. Esta técnica de superresión (SR) permite la visualización de procesos moleculares en células enteras y tiene el potencial de ser utilizada junto con la microscopía electrónica y la tomografía de rayos X para correlacionar la información estructural y funcional. Recientemente se ha encargado un microscopio SIM para muestras criogénicamente preservadas (cryoSIM) en la línea de haz de crioimágenes correlativa B24 en el sincrotrón del Reino Unido. 
Fue diseñado específicamente para imágenes 3D de muestras biológicas a temperaturas criogénicas de una manera compatible con imágenes posteriores de las mismas muestras mediante métodos de microscopía de rayos X, como la tomografía de rayos X criosumos. Este artículo de video proporciona métodos y protocolos detallados para obtener imágenes exitosas utilizando la crioSIM. Además de las instrucciones sobre el funcionamiento del microscopio crioSIM, se han incluido recomendaciones con respecto a la elección de muestras, fluoróforos y ajustes de parámetros. El protocolo se demuestra en muestras de células U2OS cuyas mitocondrias y tubulina han sido etiquetadas fluorescentemente.

Una muestra que contenía células U2OS se tiñó con una mezcla de colorante de citoesqueleto de microtúbulos verdes y tinte de mitocondrias rojas, lo que resultó en la tinción del componente de microtúbulos del citoesqueleto (verde) y las mitocondrias (rojo). Las imágenes posteriores mostraron la localización de las mitocondrias dentro de la célula, así como la disposición de los microtúbulos, destacando el marco estructural que proporcionan a la célula y el ensamblaje del citoesqueleto alrededor de orgánulos como el núcleo. La resolución en crioSIM es significativamente mayor que en la microscopía de epifluorescencia estándar (Figura 5). La Figura 6 muestra cómo el "mapa" fluorescente de un microscopio de epifluorescencia convencional se puede utilizar para localizar áreas de interés para la obtención de imágenes y la imagen correspondiente reconstruida por crioSIM desde una ubicación en la cuadrícula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo que muestra las etapas del protocolo de imágenes cryoSIM. Abreviatura: cryoSIM = Microscopía de iluminación crioestructurada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> Figura 2: La etapa crio- (A) La configuración de la crioescé etapa. (B) Una cuadrícula de muestra que se muestra sostenida por fórceps invertidos. (C) Componentes de la crio-etapa. Los puertos de conexión están etiquetados, con los colores correspondientes al naranja: fuente de alimentación, amarillo: tapa de escenario calentada, azul: dewar externo, verde: conexión a PC. Abreviaturas: PC = computadora personal; LN2 = nitrógeno líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> Figura 3: Vistas de los paneles de software de la cabina. (A) Panel principal, (B) macro etapa XY, (C) vista de mosaico, (D) vistas de cámara. Abreviatura: SLM = modulador de luz espacial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> Figura 4: Vistas de los paneles de software Cockpit. (A) Experimento de un solo sitio de pila Z. (B) Experimento de sitio único si. (C) Métodos abreviados de teclado para el software de cabina utilizado durante la adquisición de imágenes. (D) El microscopio crioSIM está in situ en la línea de haz B24 en el sincrotrón Diamond Light Source. Abreviatura: cryoSIM = Microscopía de iluminación crioestructurada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> Figura 5: Resolución de la crioSIM. (A) Vista en mosaico de una cuadrícula bajo examen. (B) Imagen de campo brillante de un área de interés (AOI). (C) Imagen pseudo-widefield en comparación con su imagen SIM (D) que muestra el aumento de la resolución. La flecha blanca indica los artefactos de reconstrucción de SIM. (E) Mapa de contraste de modulación que combina la información de intensidad de píxeles de la imagen reconstruida con la información de color de los respectivos valores de relación contraste-ruido de modulación (MCNR) de los datos brutos generados por SIMCheck2. Las regiones brillantes y oscuras muestran un contraste alto y bajo, respectivamente. Barra de escala = 10 μm. Ajustes de imagen cryoSIM: longitudes de onda de excitación/emisión: 488/525 nm, potencia láser de 50 mW, tiempo de exposición de 50 ms y 647/655 nm, potencia láser de 20 mW, tiempo de exposición de 5 ms. Abreviatura: cryoSIM = Microscopía de iluminación crioestructurada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> Figura 6: Reconstrucción de imágenes en crioSIM desde una ubicación en la cuadrícula en un mapa de fluorescencia a partir de un mapa de epifluorescencia convencional. (A, B) Superposición de mapas de imágenes de campo brillante y fluorescencia generados con un microscopio de epifluorescencia convencional. Este mapa se utiliza para localizar regiones de interés para posteriormente obtener una imagen en crioSIM. (C) La imagen crioSIM reconstruida obtenida en la ubicación que se muestra en (B). Abreviatura: cryoSIM = Microscopía de iluminación crioestructurada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells at JoVE.com

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Este protocolo demuestra cómo obtener imágenes de muestras criopreservas biológicas utilizando microscopía de iluminación crioestructurada. Demostramos la metodología mediante la obtención de imágenes del citoesqueleto de las células U2OS.

Recopilación de datos microscópicos de iluminación crioestructurada de células preservadas criogénicamente

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Este método hace posible la obtención de imágenes crioeográficas de súper resolución en células biológicas enteras para identificar con precisión las estructuras celulares. También se puede utilizar junto con otras modalidades como parte de un flujo de trabajo de imágenes correlativas. Las principales ventajas de esta técnica son que las imágenes de súper resolución se pueden realizar rápidamente en condiciones criogénicas utilizando fluoróforos convencionales y dosis de luz relativamente bajas.CyroSIM es una poderosa herramienta que proporciona información para comprender la dinámica de la ultraestructura celular en respuesta a señales internas o externas. Su aplicación incluye la producción y el despliegue de vacunas, el control de calidad, la vigilancia posterior a la comercialización, la ingeniería y optimización de anticuerpos, así como la caracterización de nanopartículas. La maniobra de muestras dentro de la etapa crio-etapa requiere práctica para garantizar la seguridad de la rejilla.También es mejor familiarizarse con los controles en la ventana Cockpit antes de la recopilación de datos. Para comenzar, retire la tapa del Dewar externo de la etapa crio-etapa y vierta nitrógeno líquido filtrado hasta que esté aproximadamente un cuarto lleno. Espere hasta que la ebullición inicial disminuya antes de verter más y llene el recipiente hasta aproximadamente dos tercios lleno.Reemplace la tapa con cuidado, apuntando la boquilla lejos del manipulador a medida que el nitrógeno líquido hierve. Una vez que el nitrógeno líquido haya dejado de salir de la salida, coloque la tubería de salida sobre el escenario Dewar en el escenario crioescépico. Conecte la fuente de alimentación, conecte el cable USB y conecte el Dewar externo al escenario.Después de la entrega de nitrógeno líquido, presione el botón de liberación en la etapa crio-etapa para permitir que ingrese a la cámara de muestra y espere de 30 a 45 minutos para que el sistema se enfríe y estabilice antes de comenzar con la adquisición de imágenes. Utilice la llave hexagonales de la herramienta de casete para abrir las dos placas del casete de transferencia de muestras. Abra las placas lo suficientemente anchas como para dejar caer la rejilla entre las dos placas, pero no abra a la posición máxima.Use forrórceps largos para levantar la caja de la rejilla de muestra del nitrógeno líquido. Gire para que la muesca se alinee con la posición de almacenamiento dentro del escenario y colóquela en el escenario. Utilice el dispositivo adecuado para abrir la tapa de la caja de almacenamiento en la posición correcta de la muestra.Usando fórceps invertidos, retire la rejilla TEM del soporte de la muestra, sumérjala dentro del nitrógeno líquido asegurándose de que el lado de la película de carbono esté colocado de modo que finalmente esté frente al objetivo en el puente de muestra y déjalo caer en su posición en el cassette de transferencia de muestra. Cierre el cartucho de muestra con la tecla hexagonl de la herramienta de casete. Utilice el punto magnético de la herramienta de cassette para levantar y montar el cartucho que contiene la rejilla en el puente de muestra.Manténgalo sumergido o cerca del nitrógeno líquido y en la orientación adecuada. Coloque el cassette plano dentro de los pasadores de posicionamiento del puente y apréndalo suavemente para asegurarse de que esté fijo. Cierre y retire la caja de almacenamiento junto con las muestras restantes.Mueva la abertura de la tapa de la crioesta etapa a la posición de imagen y apague la luz de la cámara de muestra. Deslice el escenario hacia la óptica para alinearlo debajo de la lente del objetivo, luego deje caer suavemente el objetivo en su posición usando la palanca, asegurándose de que descanse dentro de la tapa del crioescépico, pero no lo toque. Cubra el escenario y la óptica con una cortina negra opaca, luego inicie el software de control Cockpit en la PC crioSIM. Haga clic en el botón de modo de lectura para cada cámara y configárelo en CONV3 megahercios.Compruebe que la temperatura de cada cámara es de 80 grados centígrados y que el ventilador de la cámara está apagado. Encienda la cámara reflejada, bajo la luz, elija ambiente y debajo de linkam, verifique el condensador y luego haga clic en el botón de modo de video. En la ventana Vista de mosaico, aléjose para ver el contorno de la cuadrícula.Haga clic en Buscar escenario si no se puede ver y centre la cuadrícula haciendo doble clic izquierdo en el centro del círculo. Utilice las teclas arriba y abajo para enfocar la muestra hasta que la película de soporte de rejilla o cualquier otra característica relevante esté enfocada. Utilice las nueve y tres teclas del teclado numérico para cambiar el paso Z.Una vez que el escenario esté centrado, desactiva el modo de video. Recopile un mosaico de luz visible haciendo clic en Ejecutar mosaico en la vista de mosaico para producir mosaicos de imágenes de luz visible que se extienden en espiral hacia afuera desde el centro. Guarde la vista haciendo clic en Guardar mosaico.Inspeccione el mosaico de campo brillante junto con cualquier imagen de mapa de fluorescencia anterior apagando la luz ambiental y el condensador, así como el modo de video, luego encienda el láser de excitación requerido y elija la cámara y el filtro correspondientes, inicialmente a 50 milivatios durante un tiempo de exposición de 50 milisegundos. Presione cero para ajustar una imagen y la estrella para contrastar automáticamente. Alternativamente, ajuste manualmente el contraste utilizando el control deslizante en la parte inferior de la imagen.Una vez que se hayan encontrado células biológicamente interesantes con fluorescencia adecuada, marque sus posiciones usando el botón de sitio de marca en la vista Mosaico. Continúe marcando todos los sitios potenciales antes de comenzar la adquisición de imágenes. Vuelva a guardar el mosaico con los sitios marcados haciendo clic en Guardar sitios en archivo.Para unir la imagen de mosaico utilizando el software stitchEm, arrastre y suelte el archivo de mosaico de texto en el archivo stitchEm con la extensión BAT y guarde la imagen TIF combinada de los mosaicos de mosaico en la misma carpeta. Para guardar una imagen con los sitios marcados, arrastre y suelte el archivo de texto de mosaico y el archivo de texto de marcadores en el icono al mismo tiempo. Establezca el tiempo de exposición del láser en función de los recuentos y el rango dinámico en la imagen de fluorescencia en la parte inferior de la ventana de vista de la cámara.Elija qué filtro aplicar y optimice la configuración para cada longitud de onda de luz de excitación que se utilizará, encendiendo cada láser por separado. Haga clic en ambas cámaras para encenderlas. Regrese a uno de los sitios marcados y concéntrese nuevamente en la profundidad deseada.Una vez enfocado en un área de interés, desenfocarse usando la tecla de flecha hacia arriba en la ventana XY en el escenario macro para elegir la altura de la pila Z para adquirir y haga clic en Guardar arriba. Salga del foco con la tecla de flecha hacia abajo, haga clic en Guardar abajo, luego en Ir al centro, verifique que la imagen todavía esté enfocada. En la ventana Cockpit, seleccione Experimento de un solo sitio.En la lista desplegable, seleccione Iluminación estructurada. Modifique la altura de la pila para que sea igual a la altura Z más un micrómetro. Introduzca los tiempos de exposición en milisegundos para los láseres de 405 y 488 nanómetros en la fila superior para la cámara reflejada y los tiempos de exposición para los láseres de 561 y 647 nanómetros en la fila inferior para la cámara transmitida.Ingrese un nombre de archivo y haga clic en actualizar para producir un nuevo archivo que contenga la fecha y la hora sin anular los archivos anteriores, luego haga clic en Inicio. Si el nitrógeno líquido Dewar rellena la etapa crio-etapa durante la adquisición de la imagen, aborte el proceso haciendo clic en el botón ABORTar en el software Cockpit. En cada posición, recoja una pila Z utilizando luz visible apagando los láseres y encendiendo la luz ambiental y el condensador.En Experimento de un solo sitio, seleccione Z-stack y ajuste la luz ambiental a 20 milisegundos de exposición, manteniendo la altura Z. Repita este proceso para todos los sitios marcados. Una vez finalizada la obtención de imágenes, desacople el escenario y retire todas las muestras.Apague la luz de la cámara de muestra. Desenchufe el Dewar externo y decante el nitrógeno líquido restante en otro recipiente compatible con crioterapia, lo que permite que el Dewar vuelva a una temperatura normal de forma segura. Espere hasta que la opción de hornear la pantalla de crio-etapa esté disponible después de que no quede más nitrógeno líquido en la etapa Dewar.Presione el botón de horneado para ingresar al modo de calentamiento. Coloque el tapón de la tapa en el crioescéfalo. La resolución en crioSIM es significativamente mayor que en la microscopía de epifluorescencia estándar.El mapa de fluorescencia de un microscopio de epifluorescencia convencional se puede utilizar para localizar áreas de interés para la obtención de imágenes y la imagen crioSIM correspondiente se puede obtener desde una ubicación en la cuadrícula. Una muestra que contenía células U2OS se tiñó con una mezcla de colorante de citoesqueleto de microtúbulos verdes y tinte rojo de mitocondrias, lo que resultó en la tinción del componente de microtúbulos del citoesqueleto y las mitocondrias. Las imágenes posteriores mostraron la localización de las mitocondrias dentro de la célula, así como la disposición de los microtúbulos, destacando el marco estructural que proporcionan a la célula y el ensamblaje del citoesqueleto alrededor de los orgánulos.El proceso de reconstrucción de SIM puede producir artefactos que se pueden identificar utilizando SIMCheck, un complemento gratuito de imageJ. Este mapa de contraste de modulación generado utilizando SIMCheck muestra áreas de bajo contraste de modulación dentro del área del núcleo, lo que indica que esta región será más susceptible a los artefactos de reconstrucción. La flecha blanca indica un artefacto de reconstrucción.Al intentar este protocolo, asegúrese de que la muestra permanezca sumergida o cerca del nitrógeno líquido en todo momento para evitar la des-vitrificación. También preste atención a los tiempos de exposición y los recuentos en el rango dinámico, ya que esto afecta la calidad de los datos y evita el daño del láser a la muestra. Después de la crioimagen, las mismas muestras se pueden obtener con otras modalidades, como la tomografía de rayos X criosupresa, que tenemos aquí en la línea de haz B24.Al combinar imágenes crioSIM con imágenes que contienen información estructural sobre la célula, podemos responder preguntas adicionales clave sobre la ultraestructura y la función celular.

Recopilación de datos microscópicos de iluminación crioestructurada de células preservadas criogénicamente

Abstract