העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-1901566) ל- S. Xiao. המחברים רוצים להודות ל- F. Coker ו- C. Hooks על תחזוקת מתקן הגידול של המפעל, ולחורחה זמורה על העזרה הטכנית הקשורה לייצור תיבת החיסון והתאים.

1. ביצוע קופסת חיסון סטנדרטית עם מכסה עליון נשלף המורכב עם רשת
<ol><li>רכשו גליל של רשת ממברנת ניילון 50 מיקרומטר או רשת נירוסטה 48 מיקרומטר (מומלץ) מחנויות. הקפידו להזמין מספיק לחיתוך למספר חתיכות של 14 אינץ' על 26 אינץ' להחלפת רשת שחוקה.</li>
	<li>רכשו סיבית או דיקט אחד בגודל 1/4 אינץ' x 2 רגל x 4 רגל בצפיפו...

<ol>
	<li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction.">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue.">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li><li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+(Anacardium+occidentale)+in+southern+Tanzania.">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li><li>Sitterly, W. R., Spencer, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Powdery Mildews. , 369 (1978).</li><li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates.">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture &amp; Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li><li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi.">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li><li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments.">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8.">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li><li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases.">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li><li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants.">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+resistance+gene,+RPW8,+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis.">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li></ol>

לשיטת החיסון מבוססת קופסת הרשת שלנו יש מספר יתרונות על פני שיטות חיסון אחרות. ראשית, הוא יכול להשיג התפלגות שווה של נבגים אם הוא מופעל כראוי, כפי שמודגם באיור 5. שנית, השימוש ברשת של ~50 מיקרומטר, בתוספת ניתוק נבגים על ידי ניעור עדין של עלים נגועים יכול להפחית את זיהום הצמחים ע?...

טחב אבקתי הוא אחת המחלות הנפוצות והחשובות ביותר של גידולי מזון רבים וצמחי נוי1. מחקרים על מחלות טחב אבקתי היו פופולריים מאוד, כפי שמעידים למעלה מ-10,500 פרסומים כתוצאת החיפוש עם "טחב אבקתי" כמילת מפתח ב-Web of Science (נכון לנובמבר 2020). ואכן, טחב אבקתי (המיוצג על ידי Blumeria graminis) נחשב לאחד מעשרת הפתוגנים הפטרייתיים המובילים על ידי כתב העת של פתולוגיה מולקולרית של צמחים2. כימות הרגישות למחלות הוא צעד הכרחי באפיון גנים צמחיים התורמים לעמידות למחלות או לרגישות, או זיהוי תפקודי של גנים משפיעים מועמדים בטחב אבקתי. עם זאת, פנוטיפ אמין של מחלות מאתגר הרבה יותר עם טחב אבקתי בהשוואה לזה של רוב הפתוגנים הפטרייתיים האחרים, בין היתר משום שבניגוד לנבגים של האחרונים, נבגים של מיני טחב אבקתי (כגון Golovinomyces cichoracearum UCSC1 בהתבסס על ניסיון המעבדה שלנו) מראים כדאיות מופחתת לאחר שעברו תהליך השעיית מים 3,4 . חיסון לא מספק ו/או לא אחיד של צמחי בדיקה עם פתוגן טחב אבקתי מסוים עלול להוביל לתוצאות פנוטיפ לא מדויקות.
מספר שיטות חיסון דווחו למחקרי טחב אבקתי. אלה כוללים (i) הברשה של נבגים ישירות מעלים נגועים כדי לבדוק צמחים5, (ii) התזת תרחיף נבגים כדי לבדוק צמחים6, (iii) ניפוח נבגים באמצעות מגדל התיישבות המופעל בוואקום לצמחים בתחתית המגדל7, ו-(iv) העברת נבגים על ידי שימוש קומבינטורי של קרום רשת ניילון ורטט מבוסס קול8 . שיטת צחצוח הנבגים (או האבק) קלה לביצוע אך לא אחידה באופיה, ולכן ייתכן שהיא אינה מדויקת להערכה כמותית. ריסוס נבגים נוח ואחיד, אך כאמור לעיל עלול לגרום לנביטת נבגים לקויה4. שתי האחרונות (כלומר, iii-iv) הן שיטות משופרות בהרבה המסוגלות להשיג אפילו חיסון; עם זאת, שניהם אינם גמישים בהתאמת יכולת החיסון שלהם מבחינת מספר הצמחים שיש לחסן באירוע אחד, מה שהופך את אחד המנגנונים אינו טריוויאלי, והפעלתם מוגבלת לאזורי מעבדה שבהם יש ואקום ו/או מקור חשמל.
המעבדה שלנו עובדת עם אינטראקציה בין טחב אבקתי לצמחים כבר למעלה מ-20 שנה 9,10. בעשור האחרון בדקנו מספר שיטות חיסון ולאחרונה פיתחנו שיטה פשוטה אך יעילה לחיסון טחב אבקתי. שיטת הברשה זו המבוססת על רשת יכולה להבטיח חיסון אחיד, והיא פשוטה ומדרגית, ולכן כל מעבדה העובדת עם טחב אבקתי צריכה לאמץ אותה בקלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >&#160;48 &#181;m stainless steel grid mesh screen; Size: 24&#34; X 48&#34;&#160;</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >NA</td>
			<td >For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 x &#190;&#34; machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#6-32x3/8&#8221; Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing&#160; magnet door catch plates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#8-32x1/2&#34; machine screws, flat washers and nuts</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For securing corner braces and door hinge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;&#160; Size: 17 &#189;&#34; X 20&#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 20&#34;&#160;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >&#160;SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18&#34; X 30&#34;&#160;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20&#34; X 29 &#189; &#34;</td>
			<td >Professional Plastics</td>
			<td >SACR.250CEF</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-5/8&#34; cabinet door magnetic catch white</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #P110-W</td>
			<td>For making an inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2&#34; steel zinc-plated corner brace (8-Pack)&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >&#160;Model #13611&#160;</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3&#34; Corner Clamp</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>SKU 63653, 1852, 60589</td>
			<td>For making inoculation chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3/4&#34;&#160; steel zinc plated corner brace (4-Pack)</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #13542</td>
			<td>For making an inoculation box &#38; chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-7/8&#34; zinc-plated light duty door pull handles</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model #15184</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine fan-blender brushes</td>
			<td>Michaels Store</td>
			<td>M10472846&#160;</td>
			<td>For inoculation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kelleher 3/4&#34; x 3/4&#34; x 36&#34; wood square dowel&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >NA</td>
			<td>For making the lid of an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium density fiberboard (1/4&#34; x 2&#39; x 4&#39;);&#160;</td>
			<td >Home Depot</td>
			<td >Model# 1508104</td>
			<td>For making an inoculation box</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Round glass coverslips with a 500 &#181;m grid</td>
			<td >ibidi USA Inc.</td>
			<td >10816</td>
			<td>For determining&#160; spore density</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an easy and flexible inoculation method for accurately assessing powdery mildew-infection phenotypes of arabidopsis and other plants

צמצום אובדן יבולים כתוצאה ממחלות פטרייתיות דורש הבנה משופרת של המנגנונים השולטים בחסינות הצמחים ובפתוגנזה פטרייתית, אשר בתורם דורשים קביעה מדויקת של פנוטיפים של מחלות של צמחים בעת הדבקה בפתוגן פטרייתי מסוים. עם זאת, פנוטיפ מדויק של מחלות עם פתוגנים פטרייתיים ביוטרופיים בלתי ניתנים לזיהוי כגון טחב אבקתי אינו קל להשגה ויכול להיות שלב מגביל קצב בפרויקט מחקר. כאן, פיתחנו מערכת פנוטיפית מחלות בטוחה, יעילה וקלה לתפעול תוך שימוש באינטראקציה של טחב אבקתי-ערבידופסיס כדוגמה. מערכת זו מורכבת בעיקר משלושה מרכיבים: (i) קופסת חיסון מעץ המצוידת במכסה נשלף המורכב על רשת נירוסטה או ניילון של ~ 50 מיקרומטר נקבוביות לחיסון שטוח של צמחים עם נבגי פטריות, (ii) תא פלסטיק שקוף עם פתח קדמי קטן למזעור בריחת נבגים תוך ביצוע חיסון בפנים, ו-(3) שיטת פירוק והפצה של נבגים לחיסון אחיד ויעיל. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים את השלבים והפרמטרים להכנת קופסת החיסון ותא הפלסטיק בעלות נמוכה, והדגמת וידאו כיצד להשתמש במערכת כדי לאפשר חיסון אחיד בנבגי טחב אבקתיים, ובכך לשפר את הדיוק ואת יכולת השחזור של פנוטיפ המחלה.

כאן אנו מציגים שיטה חדשה לחיסון נבגי טחב אבקתיים שקל להכין, להפעיל ולהתאים. איור 1 מראה את ההרכבה של תיבת החיסון הסטנדרטית עם דגש על ייצור המכסה הנשלף המורכב עם רשת קרום של 50 מיקרומטר. איור 2 מראה את הרכבת תא החיסונים. איור 3 ממחיש את השלבים המר...

Watch this Scientific Journal Video about An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants at JoVE.com

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת הפצת נבגים פשוטה המורכבת מקופסת חיסון עם רשת ~ 50 מיקרומטר ותא פלסטיק שקוף. ניתן להשתמש בו כדי לחסן צמחים באופן שווה בנבגי טחב אבקתיים, ובכך לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של פנוטיפים של מחלות של צמחים נחקרים.

שיטת חיסון קלה וגמישה להערכה מדויקת של פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי של ערבידופסיס וצמחים אחרים

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

טחב אבקתי הוא מחלה צמחית חשובה. קביעה מדויקת של פנוטיפ המחלה דורשת אפילו חיסון של הפתוגן. מכיוון שהשיטות הקיימות אינן יעילות, פיתחנו פרוטוקול זה.שיטת חיסון הנבגים שלנו יכולה להשיג בקלות אפילו חיסון, והיא פשוטה וניתנת להרחבה. לפיכך, כל מעבדה העובדת עם טחב אבקתי יכולה בקלות להשתמש בשיטה זו. החוקרים יכולים גם להרכיב רשת על קופסת קרטון ולהשתמש בה לחיסון נבגים.כיצד לנתק נבגים ולצחצח אותם דרך רשת הוא צעד קריטי. אז להדגים את זה בווידאו יכול להיות מאוד מועיל. עבור פרוטוקול זה, קבל גליל של רשת קרום ניילון 50 מיקרומטר או רשת נירוסטה של 48 מיקרומטר.חותכים דיקט גדול בגודל בינוני לחתיכות של 24.5X10 אינץ' ו-12X10 אינץ' להכנת קופסת חיסון. כדי ליצור מכסה עליון נשלף עם רשת, חתכו את הדיבל המרובע הארוך מעץ לשני סטים של 26 אינץ' ו-12.75 אינץ'. הדביקו ומסמרו את ארבעת החלקים כך שיתאימו מסביב לקופסה.קחו יריעות אקריליק והרכיבו את כל יריעות האקריליק לקופסה, באמצעות שמונה מלחציים פינתיים. חותכים חלון פתיחה בגודל 7X2 אינץ 'בצד הקדמי של יריעת האקריליק של הקופסה. כדי להכין נבגי טחב אבקתיים טריים כאינוקולה, לגדל צמחים מוטנטיים נקיים של אראבידופסיס עם פגיעה במערכת החיסון4-1 בתא גידול בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 65% במשך שישה עד שמונה שבועות.לגדל את הצמחים כדי לקבוע פנוטיפים זיהום בדירות סטנדרטיות. יש לחסן אחד או מחצית מצמחי הפד4-1 כדי לבנות מספיק נבגי טחב אבקתיים טריים. כאשר נבגים טריים מצמחים נגועים זמינים, העבירו דירה של צמחים לתוך תיבת החיסון בתוך תא החיסון לבדיקת זיהום.חותכים 15 עד 20 עלי ערבידופסיס נגועים בכבדות, ומניחים להם להתייבש אם יש מים מעובים. החזיקו אחד או שניים עלים הפוכים ביד אחת עם זוג מלקחיים ארוכים. לאחר מכן הכניסו את שתי הידיים דרך פתח החדר ופגעו בעדינות בזרוע המלקחיים עם זוג מספריים, תוך כדי הזזה איטית של העלים מעל הרשת המותקנת על תיבת החיסון.הברישו את הנבגים עם מברשות בלנדר מאוורר עדינות דרך כל משטח הרשת בכיוונים שונים כדי למקסם את הפיזור השווה של הנבגים על הצמחים. טפחו בעדינות על הרשת כמה פעמים עם המברשות כדי לנער את הנבגים שנתקעו ברשת. לאחר שהנבגים שוקעים, הוציאו את הדירה המכילה את הצמחים המחוסנים מקופסת החיסונים.מכסים את הדירה בכיפת פלסטיק ומניחים אותה בתא גידול בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-65% לחות יחסית. פנוטיפ המחלה יכול להתבצע ב 5 או 8 עד 12 ימים לאחר החיסון. המירו קופסאות קרטון לקופסת חיסון על ידי הסרת הצדדים העליונים והתחתונים של הקופסה, הדבקת הפינה כדי למצק אותה והרכבת רשת של 50 מיקרומטר בחלק העליון עם דבק.הזיזו את השטוח המכיל את הצמחים בתוך תא החיסונים, והניחו את קופסת החיסונים הקטנה יותר על גבי הדירה כדי לכסות את הצמחים. לאחר מכן לנתק ולצחצח את הנבגים. הכינו קופסת חיסונים קטנה וקצת יותר גדולה מצלחת פטרי.אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במקרר עד לשימוש. חותכים עלה אחד או שניים מורחבים במלואם מבסיס הפטיולה כדי שכל צמח ייבדק. מכניסים את הפטיולה של העלים המנותקים למדיום האגר בזווית של 30 מעלות.לחסן את העלים בתוך תא החיסון, ולהעביר את הצלחת עם המכסה לתא הצמיחה. להערכת פנוטיפים של זיהום, מעבירים את העלים לצלחת אגר MS אספטית טרייה ארבעה או חמישה ימים לאחר החיסון. חותכים את בסיס הפטיולה לפני הכנסת העלים למדיום האגר הטרי.להעריך את פנוטיפים המחלה בשמונה או תשעה ימים לאחר החיסון. הניתוח המיקרוסקופי הציג פיזור שווה של נבגים על השקופיות המיקרוסקופיות בתחתית הדירה. צפיפות הנבגים המחושבת, שהתפזרו בשישה מקומות שונים לאחר חיסוני האור, לא הראתה הבדלים משמעותיים.תוצאות דומות הושגו לאחר חיסונים כבדים בנבגים. אחידות החיסון נבדקה בין גנוטיפים שונים של צמחים ב-12 יום לאחר חיסון כבד. צמחי הפד4-1 הראו רגישות מוגברת למחלות בהשוואה לקולומביה 0, צמחי הבר.שימוש בנבגים טריים בכמות מספקת, המיוצרים כ-10 ימים לאחר החיסון, על צמחים רגישים, הם חשובים, משום שנבגים טריים קלים יותר לעקירה, וסביר יותר שהם יבססו התיישבות. טחב אבקתי מאכלס רק תאי אפידרמיס צמחיים. בידוד של תאים נגועים בטחב אבקתי על ידי קילוף האפידרמיס, או מיקרו-דיסקציה בלייזר, יאפשר מחקר תעתיק ופרוטאומי ממוקד יותר של תגובות המארח.שיטה זו תסייע לחוקרים לקבוע ביעילות רבה יותר פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי, ולכן אמורה לאפשר מחקרים פונקציונליים יעילים יותר על אינטראקציות טחב אבקתי צמחי.