تم دعم العمل المقدم في هذه الدراسة ماليا من قبل وكالة البحوث السلوفينية (رقم التمويل الأساسي للبحوث. P3-0396 و I0-0029 ، بالإضافة إلى أرقام المشاريع البحثية. J3-9289 و N3-0048 و N3-0133) ومن قبل صندوق العلوم النمساوي / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (المنح الثنائية I3562--B27 و I4319--B30). ونشكر ماروشا روشر وماسا تشاتر ورودي ملاكار على المساعدة التقنية الممتازة.

يعلن المؤلفون أن البحث تم إجراؤه في غياب أي مصلحة تجارية أو مالية.

البنكرياس الثدييات هو إفرازات كبيرة وغدة صماء. يشكل الجزء الخارجي 96-99٪ من إجمالي حجم البنكرياس ويتكون من الأسيني والقنوات. يتكون جزء الغدد الصماء من عدد كبير من جزر لانغرهانز التي تمثل 1-4٪ المتبقية من إجمالي حجم البنكرياس1. يفرز الجزء الخارجي إنزيمات هضمية رئيسية تكسر البوليمرات الغنية بالطاقة في الطعام ، بالإضافة إلى سائل غني بالبيكربونات ، والذي يتحد مع إفرازات الجهاز الهضمي الأخرى لتوفير بيئة مناسبة لعمل الإنزيمات. يفرز جزء الغدد الصماء الهرمونات التي تنظم التوزيع والتخزين والإطلاق بين الأكل للمغذيات الغنية بالطاقة. على الرغم من أن الأنسجة الخارجية متخلفة نسبيا والغدد الصماء متطورة نسبيا عند الولادة ، إلا أن الأولى سرعان ما تتضخم في الأخيرة عند الفطام2،3،4. تميزت الدراسات المبكرة لوظيفة البنكرياس بولادة علم وظائف الأعضاء الحديث ، وقد أعقبت التطورات المنهجية الرئيسية في هذا المجال اختراقات علمية رئيسية5. يعد العمل مع البنكرياس تحديا تقنيا بسبب البنية المعقدة للغدة ، ولكنه أيضا دافع كبير بسبب أمراض مثل سرطان البنكرياس والتهاب البنكرياس والسكري التي تشكل تهديدات كبيرة للصحة العامة ، والتي تحتاج إلى نهج علاجية جديدة.
تم تطوير الجزر المعزولة6 و acini7,8 وشظايا القنوات واستخدامها لعقود كطرق قياسية ذهبية بسبب مزاياها مقارنة بخطوط الخلايا وخلايا الغدد الصماء الأولية المشتتة و acinar و ductal cells 9,10. على الرغم من التحسن الملحوظ في وظيفة مجموعات الخلايا المعزولة ، إلا أن هذه الطرق لا تزال تنطوي على إجهاد ميكانيكي وإنزيمي كبير ، وتعزل الخلايا عن الأنسجة المحيطة ، وبالتالي تفتقر إلى تفاعلات paracrine والدعم الميكانيكي ، والأهم من ذلك ، أنها مصحوبة بتغييرات كبيرة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي11,12,13 . تم تطوير شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفئران في عام 2001 بدافع الحاجة المتصورة لتطوير منصة تجريبية مشابهة لشرائح الدماغ والغدة النخامية والغدة الكظرية مع الاتصالات المحفوظة بين الخلايا ، وتفاعلات paracrine ، واللحمة المتوسطة ، وبنية الأنسجة ، وكذلك بدون بعض أهم أوجه القصور في الطريقة القياسية الذهبية في أبحاث الجزر في ذلك الوقت - الجزر المعزولة12 ، 14. ومن بين أوجه القصور هذه الأضرار التي لحقت بالطبقات الخارجية، وعدم إمكانية الوصول إلى مناطق الجزر الأساسية، والحاجة إلى الزراعة مع تأثيرات مهمة محتملة على هوية الخلية وعلم وظائف الأعضاء12،15. علاوة على ذلك ، تتيح طريقة شرائح الأنسجة إجراء دراسات على النماذج الحيوانية ذات بنية الجزر المختلة بشكل كبير حيث يستحيل عزل الجزر ، أو عندما يكون محصول الجزر منخفضا للغاية من خلال العزل التقليدي16،17،18،19،20،21.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الشريحة أكثر ملاءمة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثناء تطور مرض السكري والتهاب البنكرياس ، على سبيل المثال ، لأنها تمكن من إلقاء نظرة عامة أفضل على الأنسجة بأكملها ومتوافقة أيضا مع دراسة الاختلافات الإقليمية. الأهم من ذلك ، على الرغم من التركيز المبكر على جزء الغدد الصماء ، فإن طريقة شريحة الأنسجة تمكن بطبيعتها من دراسة مكونات الإفرازات9،22،23. خلال العقد الأول بعد إدخالها ، تم استخدام الطريقة للدراسات الكهروفسيولوجية لخلايا بيتا14،24،25،26،27،28،29 وألفا30،31 وكذلك لفحص النضج المورفولوجي والوظيفي للبنكرياس2،3 . بعد عقد من الزمان في عام 2013 ، تم تكييف الطريقة بنجاح لتصوير الكالسيوم في الخلايا الحية للخلايا الجزرية باستخدام CLSM لتوصيف استجاباتها للجلوكوز32 ، وأنماط الاتصال الوظيفية 33 ، والعلاقة بين إمكانات الغشاء والكالسيوم داخل الخلايا من خلال الجمع بين صبغة الكالسيوم الفلورية مع صبغة غشاء محتمل34. في وقت لاحق من نفس العام ، تم استخدام الطريقة أيضا لتقييم ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا الأسينار22,35. على مدى السنوات التالية ، تم استخدام شرائح أنسجة البنكرياس في عدد من الدراسات المختلفة وتكييفها بنجاح مع الخنازير والأنسجة البشرية9،36،37،38،39،40،41. ومع ذلك ، إذا أخذنا معا ، فإن تصوير الكالسيوم - في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية بشكل عام وفي الجزر بشكل خاص - لا يزال يتم تنفيذه في الغالب من قبل هذه المجموعة. قد يكمن أحد الأسباب الرئيسية لذلك في الجمع بين إعداد شريحة الأنسجة الصعبة تقنيا ، والحاجة إلى مجهر بؤري ، وتحليل البيانات المعقدة إلى حد ما. والهدف الرئيسي من هذه الورقة هو جعل هذه الطريقة القوية في متناول المستخدمين المحتملين الآخرين.
هناك بالفعل بعض المقالات المنهجية الممتازة التي تتعامل بالتفصيل مع إعداد شرائح الأنسجة واستخدام الشرائح للدراسات الهيكلية والإفرازات ، ولكن ليس لتصوير الكالسيوم البؤري9،42،43. لذلك ، تركز هذه الورقة على بعض النصائح والحيل الإضافية أثناء إعداد الشرائح ، وعلى الخطوات الحاسمة لتحميل الصبغة بنجاح ، والحصول على الصور ، وكذلك على الخطوات الرئيسية لتحليل بيانات الكالسيوم الأساسية. ولذلك، ينبغي النظر إلى هذه المساهمة على أنها مكملة للطريقة المذكورة أعلاه وليست بديلا لها. وبالمثل ، يجب النظر إلى تصوير الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية على أنه نهج تجريبي يستخدم للإجابة على أسئلة محددة ، وبالتالي فهو مكمل بدلا من أن يكون بديلا مطلقا لنهج تصوير الكالسيوم الأخرى في فسيولوجيا البنكرياس مثل القنوات المعزولة أو الأسيني ، والجزر المعزولة ، والمواد العضوية ، والجزر المزروعة في الغرفة الأمامية للعين ، والتسجيلات في الجسم الحي11،44،45،46،47،48. ربما يكون أفضل دليل على وعد تصوير الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الفأرية هو التسجيلات الناجحة الأخيرة لديناميات الكالسيوم في الخلايا الوسيطة الجزرية مثل pericytes49 و macrophages50 ، وكذلك في الخلايا القنية23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفئران هي إعداد فريد من نوعه في الموقع مع الاتصالات بين الخلايا المحفوظة وبنية الأنسجة التي تنطوي على تغييرات أقل بكثير من المستحضر من الجزر المعزولة أو الأسيني أو القنوات أو الخلايا المشتتة الموصوفة في الدراسات النموذجية في المختبر. من خلال الجمع بين شريحة أنسجة البنكرياس الحادة وتصوير الكالسيوم للخلايا الحية في المجهر الضوئي بالليزر البؤري (CLSM) ، يمكن دراسة إشارات الكالسيوم في عدد كبير من خلايا الغدد الصماء والإفرازات الخارجية في وقت واحد ، بدقة خلية واحدة أو حتى دون الخلية. تسمح الحساسية بالكشف عن التغيرات وتمكن من دراسة الموجات بين الخلايا والاتصال الوظيفي وكذلك دراسة اعتماد الاستجابات الفسيولوجية للخلايا على توطينها داخل الجزيرة وعلاقة paracrine مع الخلايا الأخرى. أخيرا ، من منظور رعاية الحيوان ، فإن تسجيل الإشارات من عدد كبير من الخلايا في وقت واحد يقلل من عدد الحيوانات المطلوبة في التجارب ، مما يساهم في مبدأ استبدال 3R وتقليله وصقله.

حقن محلول الأغاروز في قناة البنكرياس هو الخطوة الأكثر أهمية في إعداد شريحة أنسجة البنكرياس. يمكن التعرف على الحقن الناجح عن طريق تبييض أنسجة البنكرياس ، كما هو موضح على الجانب الأيسر من الشكل 3A ، في حين يتم عرض جزء حقن غير كامل من البنكرياس على الجانب الأيمن من الشكل 3A. يمكن التعرف على جزر لانغرهانس بالعين المجردة أو تحت المجهر المجسم، وهذا يساعد في قطع الأجزاء المناسبة من البنكرياس لتضمينها لاحقا في كتل الأغاروز (الشكل 3 ب). في شريحة أنسجة البنكرياس الفأرية المقطوعة حديثا ، يمكن تمييز جزر Langerhans بسهولة عن الأنسجة الخارجية المحيطة واللحمة المتوسطة كبقع بيضاء تحت المجهر المجسم (الشكل 3C) أو كهياكل بنية تحت المجهر الضوئي (الشكل 3D). يمكن استخدام شرائح أنسجة البنكرياس لأنواع متميزة من التجارب لمدة 12 ساعة على الأقل بعد التقطيع. بالإضافة إلى التقييم المورفولوجي الإجمالي تحت المجهر المجسم ، والمجهر الضوئي ، والاستجابات الوظيفية للخلايا أثناء تصوير الكالسيوم ، يمكن تقييم صلاحية شرائح أنسجة البنكرياس (الشكل 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> الشكل 4: صلاحية الخلايا داخل شريحة الأنسجة. تم تحديد صلاحية الخلايا باستخدام فحص الأحياء / الأموات. الخلايا الحية ملطخة بواسطة Calcein AM (كما هو موضح باللون الأخضر) ، في حين أن الخلايا الميتة ملطخة ب ethidium homodimer-1 (كما هو موضح باللون الأحمر). تشير الخطوط الصفراء إلى موضع المقطع العرضي X-Y من مكدس Z المعروض في الأسفل واليمين. العمق الكامل ل Z-stack هو 88 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">.</a>
بالنسبة لتجارب تصوير الكالسيوم ، يحتاج مؤشر الكالسيوم الفلورسنت إلى اختراق بضع طبقات من الخلايا. يعرض الشكل 5A التحميل الناجح لصبغة مؤشر Ca2+ القابلة للنفاذ الخلوي في شريحة أنسجة البنكرياس التي يمكن من خلالها التعرف على الخلايا الجزرية الفردية والخلايا الأسينارية. في المقابل ، فإن الشرائح في الشكل 5B-D ليست مثالية بسبب الاختراق غير الناجح للصبغة (الشكل 5B) ، ونقص الخلايا الجزرية (الشكل 5C) ، والكثير من الأنسجة الميتة على السطح (الشكل 5D). يمكن التخلص من هذه الشرائح ، أو التحقق من وجود جزر إضافية يتم قطعها أو تلوينها بشكل أفضل (انظر الجدول 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها) ، أو استخدامها لتسجيل استجابات الخلايا الإفرازية.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> الشكل 5: أمثلة على المستحضرات القابلة للاستخدام وغير القابلة للاستخدام . (أ) مثال على التحضير الناجح لشريحة أنسجة البنكرياس مع خلايا ملطخة جيدا في جزر لانغرهانز ، وكذلك الخلايا القنوية والأنسجة الأسينية المحيطة. (ب) مثال على شريحة أنسجة ملطخة بشكل سيء. (ج) مثال على جزيرة لانغرهانس التي توقفت هيكليا. (د) مثال على جزيرة لانغرهانس التي تحتوي على العديد من الخلايا الميتة والكثير من الحطام. يعرض جدول البحث "التوهج ، التوهج السفلي" على اليمين 0 كثافة باللون الأخضر والتشبع باللون الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تظهر النتائج التمثيلية من تصوير الكالسيوم باستخدام صبغة مؤشر Ca2+ القابلة للنفاذ الخلوي في الشكل 6. في الشكل 6 أ ، يتم تقديم صورة عالية الدقة لشريحة أنسجة البنكرياس ، تحتوي على جزيرة من Langerhans ، وأنسجة acinar ، وقناة البنكرياس. للحصول على تمييز أفضل ، يتم تلوين الجزء الصماء والإفرازات والأقنية من شريحة أنسجة البنكرياس المعروضة في الشكل 6A في الشكل 6B. يمكن أن يؤدي استخدام المحفزات المناسبة إلى التمييز وظيفيا بين الخلايا الجزرية المختلفة ، أو الخلايا الجزرية وغير الجزرية51. عادة ما تستجيب خلايا بيتا لتحفيز النبض المربع بواسطة الجلوكوز مع زيادة عابرة في [Ca2+] IC تليها تذبذبات الكالسيوم السريعة على هضبة مستدامة (الشكل 6C ، اللوحة العلوية).
نظرا لأن جميع خلايا بيتا مقترنة في تزامن وظيفي واحد كبير ، فإن هذه التذبذبات متزامنة أيضا بشكل جيد للغاية بين الخلايا المختلفة عن طريق نشر موجات IC [Ca2 +] 32,34,52,53,54 (الشكل 7C). قد تكون تذبذبات IC الأبطأ [Ca2+] مع فترة 5-15 دقيقة وراء التذبذبات السريعة أو حتى تكون النوع السائد من reponse55,56. وقد يكشف نفس البروتوكول البسيط عن أنواع أخرى من الاستجابات، لا سيما في محيط الجزر الصغيرة (الشكل 6C، اللوحة السفلية). نظرا لأن هذه الخلايا لا تتزامن مع خلايا بيتا وتستجيب بتذبذبات أسرع وأكثر انتظاما موجودة بالفعل في ظروف الجلوكوز المنخفضة أو مع انخفاض النشاط ، فإن هذه الاستجابات توحي بشدة بالخلايا غير بيتا21،32،57،58. ومع ذلك ، فإن توصيفها الوظيفي النهائي يتطلب بروتوكولات أكثر تعقيدا مع خطوات تحفيز إضافية أو نهج بديلة ، والتي تتم مناقشتها أدناه. يتم عرض الاستجابات النموذجية للخلايا الأسينارية والقنوية في الشكل 6D والشكل 6E ، على التوالي. ارجع إلى الأدبيات لمزيد من التفاصيل حول الخلايا الأسينية والقنوية22،23،35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> الشكل 6: النتائج التمثيلية لديناميات الكالسيوم في أنواع متميزة من خلايا البنكرياس . (أ) صورة عالية الدقة لجزيرة لانغرهانس مع الأنسجة المحيطة بها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (B) تحديد أجزاء متميزة من أنسجة البنكرياس مع أنسجة أسينار مبينة باللون الأصفر ، وجزيرة لانجرهانز تظهر باللون الأحمر ، وجزء من شجرة الأقنية باللون الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (C) الآثار النموذجية لديناميات الكالسيوم في خلايا بيتا والخلايا غير المفترضة أثناء التحفيز باستخدام الجلوكوز 12 ملليمتر ؛ تم استخدام الجلوكوز 3 mM للظروف غير المحفزة. يتم وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها للتمييز الأكثر تحديدا للخلايا غير بيتا في قسم المناقشة. (د) أثر نموذجي لديناميات الكالسيوم للخلايا الأسينار التي تحفزها 25 نانومتر أستيل كولين. (ه) أثر نموذجي لديناميات الكالسيوم للخلايا القنية التي يحفزها حمض تشينوديوكسيكوليك 1 ملليمتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد التصوير الناجح للكالسيوم ، يتم تصدير البيانات أولا وتصحيحها للتبييض عن طريق مزيج من الملاءمة الأسية والخطية ، كما هو موضح في قسم البروتوكول. وترد في الشكل 7 ألف سلسلة زمنية قبل تصحيح التبييض وبعده. بعد ذلك ، يمكن تحليل العديد من المعلمات في مرحلة التنشيط والتعطيل للاستجابة وكذلك مرحلة الهضبة. يمكن قياس التأخير في بداية زيادة [Ca2+] IC بعد التحفيز كما هو موضح في التأخيرA في الشكل 7B وعدم التجانس في التأخير بين الخلايا الفردية (التأخيرA1). يمكن استخدام نفس المعلمات (تأخيرD وتأخيرD1) لوصف مرحلة إلغاء التنشيط. بعد الزيادة الأولية العابرة [Ca 2+] IC ، تتميز مرحلة الهضبة في معظم خلايا بيتا البنكرياسية في الجزيرة بتذبذبات IC عالية التردد منتظمة نسبيا [Ca2+]. يمكن وصف مرحلة الهضبة من خلال تحليل المعلمات الوظيفية الكلاسيكية. ويعرض الشكل 7C العرض التخطيطي لفترات تذبذبات [Ca2+] IC وترددها ونسبتها المئوية للوقت النشط. في تصوير الكالسيوم بمعدلات اكتساب أعلى من 10 هرتز ، يمكن أيضا التعرف بوضوح على موجات الكالسيوم المنتشرة بشكل متكرر عبر الجزيرة (الشكل 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> الشكل 7: تحليل بيانات السلاسل الزمنية . (أ) تصحيح بيانات السلاسل الزمنية للتبييض الضوئي. (ب) تحليل حالات التأخير في التنشيط بعد التحفيز وتعطيل التنشيط بعد التوقف عن التحفيز باستخدام الجلوكوز 12 ملليمتر. يشار إلى مدة التحفيز بالشريط الرمادي الفاتح المظلل في الصورة. (ج) تحليل عدة بارامترات لمرحلة الهضبة: أولا) مدة التذبذب المحددة عند نصف الارتفاع، ثانيا) تواتر التذبذبات التي تحددها فترات التذبذب البيني. III) الوقت النشط كنتاج لتكرار ومدة التذبذبات. I-IV) التأخير بين التذبذبات في أي موجة معينة من التذبذبات التي تنتشر عبر جزيرة لانغرهانز التي تحددها التأخيرات (Δt) في الوقت الذي تصل فيه خلية واحدة إلى نصف ارتفاع التذبذب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

نقدم إعداد شرائح أنسجة البنكرياس الحادة واستخدامها في المجهر المجهري للمسح بالليزر البؤري لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في وقت واحد في عدد كبير من الخلايا الحية ، على مدى فترات زمنية طويلة ، وبدقة مكانية زمانية عالية.

المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري لديناميكيات الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للفأر

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

بالاقتران مع تصوير الكالسيوم في الخلايا الحية ، تمكن تقنية شريحة أنسجة البنكرياس الحادة من دراسة الموجات بين الخلايا والاتصال الوظيفي متعدد الخلايا بدقة عالية على مدى فترات زمنية طويلة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة ، وتحافظ على بنية الأنسجة ، وتقلل من الإجهاد الأنزيمي والميكانيكي المحدود مع الحفاظ على إنتاجية عالية من الأنسجة. من خلال الكشف عن التغيرات الوظيفية والمورفولوجية أثناء تطور المرض ، تساعد هذه التقنية في فهمنا للأمراض المرتبطة بالبنكرياس ، مثل مرض السكري.يمكن تطبيق تقنية شرائح الأنسجة هذه على أنسجة الدماغ والغدة النخامية والغدة الكظرية مع التركيز على الحفاظ على الاتصال بين الخلايا وتفاعلات الباراكرين وبنية الأنسجة. للتحضير لحقن الأغاروز في بنكرياس الفأر ، املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بأغاروز سائل 40 درجة مئوية وقم بتجهيز المحقنة بإبرة قياس 30. بعد تغطية الإبرة بعناية بغطاء ، ضع نهاية إبرة المحقنة لأسفل ، مع كامل حجم الأغاروز تحت سطح الماء ، في حمام مائي 40 درجة مئوية.فقاعة زجاجة من محلول خارج الخلية مع الكربوجين ، باستمرار على الجليد ، بمعدل 1.5 ملليلتر في الدقيقة عند الضغط الجوي ودرجة حرارة الغرفة لضمان الأوكسجين ودرجة الحموضة 7.4. لإجراء حقن الأغاروز ، ضع فأرا بالغا تم قتله الرحيم تحت مجهر ستيريو والوصول إلى بطن الفأر عبر بضع البطن. حرك الأمعاء برفق إلى الجانب الأيسر لفضح القناة الصفراوية الشائعة واستخدم الملقط لرفع الطرف الاثني عشر للقناة قليلا لتحديد موقع حليمة فاتر.استخدم مرقئ لتثبيت القناة الصفراوية في الحليمة الاثني عشر لمنع تسرب الأغاروز من القناة إلى الاثني عشر واستخدم ملقطا حادا صغيرا للوصول إلى أسفل القناة الصفراوية الشائعة لكسر الغشاء الذي يربط القناة بأنسجة البنكرياس. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والنسيج الضام من القناة ، ضع القناة بشكل عمودي على أطراف زوج من الملقط الأكبر ، واضغط بقوة على مكبس المحقنة ، وحقن الأغاروز السائل اللزج في الطرف القريب من القناة الصفراوية المشتركة لمدة 20 إلى 30 ثانية. عندما يصبح النسيج أبيض ومنتفخا قليلا ، قم بإزالة المحقنة وصب ببطء 20 ملليلتر من محلول الثلج البارد خارج الخلية على البنكرياس لتبريد الأنسجة وتصلب الأغاروس.للحصول على شرائح أنسجة البنكرياس ، استخدم الملقط والمقص الناعم المقطوع لنقل البنكرياس المحقون بالأغاروز بلطف إلى طبق بتري 100 ملم يحتوي على 40 ملليلتر من محلول خارج الخلية البارد المثلج. قم بتدوير الطبق لشطف الأنسجة ونقل البنكرياس إلى طبق ثان من محلول خارج الخلية بارد مثلج. استخدم الملقط والمقص لقطع قسم البنكرياس الأبيض المحقون جيدا إلى ما يصل إلى ست قطع من 0.1 إلى 0.2 سنتيمتر مكعب وإزالة أي أنسجة ضامة ودهنية متبقية من قطع الأنسجة.ضع الكتل النظيفة في طبق بتري سفلي غير لزج 35 ملم يحتوي على ما يقرب من خمسة ملليلترات من الأغاروز السائل 40 درجة مئوية وضع طبق بتري على الفور على الجليد. عندما يتصلب الأغاروز ، أمسك طبق بتري رأسا على عقب فوق غطاء طبق بتري 100 ملم واستخدم نصف شفرة حلاقة لقطع الهامش بعناية بين الجدار الجانبي لطبق بتري والأغاروز لإزالة الأغارو من الطبق. استخدم شفرة الحلاقة لقطع مكعبات فردية ، يحتوي كل منها على كتلة نسيج واحدة من الأغاروز ، من الأغاروز المحرر واستخدم غراء سيانو أكريليت لربط الكتل بلوحة عينة من الاهتزاز.املأ غرفة القطع في الاهتزاز ب 150 ملليلتر من محلول خارج الخلية البارد المثلج باستمرار مع الكربوجين. قم بتثبيت لوحة العينة على الاهتزاز وقم بتركيب شفرة حلاقة جديدة. أحط الغرفة بالثلج وأضف مكعبي ثلج بحجم 10 ملليلتر مصنوعين من محلول خارج الخلية مكمل بستة ملليمولات جلوكوز.اضبط القطاعة على 0.05 إلى 1 ملليمتر في الثانية و 70 هرتز ، ثم ابدأ في التقطيع للحصول على شرائح أغاروز سميكة 140 ميكرون بمساحة سطح تتراوح من 20 إلى 100 ملليمتر مربع. استخدم فرشاة طلاء ناعمة لنقل كل شريحة بعناية إلى طبق بتري 100 ملم مملوء ب 40 ملم من مخزن HEPES العازل مع ستة ملليمولات من الجلوكوز. لإعداد صبغة الكالسيوم ، قم بإذابة 50 ميكروغرام من صبغة مؤشر الكالسيوم القابلة للنفاذ الخلوي ، و 7.5 ميكرولتر من DMSO ، و 2.5 ميكرولتر من poloxamer ، و 6.667 ملليلتر من HBS في أنبوب غطاء لولبي 15 ملليلتر.استخدم ماصة لخلط المحلول جيدا لمدة 20 ثانية قبل غمر الأنبوب في غرفة حمام بالموجات فوق الصوتية والدوامة ، كل منها لمدة 30 ثانية. ثم أليكوت 3.333 ملليلتر من محلول صبغة مؤشر الكالسيوم الناتج في طبق بتري واحد 5 ملليلتر لكل 10 شرائح من الأنسجة ليتم وضع علامة عليها. لتحميل الصبغة، استخدم فرشاة طلاء ناعمة رقيقة لنقل ما يصل إلى 10 شرائح أنسجة إلى كل طبق من محلول الصبغة ووضع الأطباق على شاكر مداري لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 40 دورة في الدقيقة محمية من الضوء.في نهاية الحضانة ، انقل ما يصل إلى 20 شريحة ملطخة إلى أطباق بتري فردية سعة 60 ملليلتر مليئة ب HBS الخالي من الصبغات. بالنسبة لتصوير الكالسيوم بواسطة المجهر البؤري ، حدد تكبيرا 20 أو 25 مرة واضبط وضع الاكتساب على التصوير بفاصل زمني ، والثقب إلى 100 إلى 200 ميكرون ، والإثارة والانبعاثات للفلوروفور المستخدم في التجربة. قم بتركيب غرفة التسجيل ونظام التروية على المرحلة التي يتم التحكم في درجة حرارتها من المجهر ووضع المدخل والمخرج على الحواف البعيدة لغرفة التسجيل.اضبط معدلات التدفق الداخلة والخارجة على واحد إلى ملليلتر في الدقيقة. اضبط درجة حرارة نظام الغزير على 37 درجة مئوية وابدأ الوفرة باستخدام المحلول غير المحفز. لتسجيل ديناميكيات الكالسيوم في الأنسجة ، ضع شريحة نسيج واحدة في غرفة التسجيل وشل حركة الأنسجة بوزن بلاتيني على شكل حرف U مع شبكة نايلون مشدودة.استخدم خيار المجال الساطع لتحديد موقع الهيكل محل الاهتمام واستخدم التصوير الحي لوضع الهياكل المدروسة في مجال الرؤية. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، اضبط طاقة الليزر، وتضخيم الكاشف، وربط متوسط الخط مع الحفاظ على الحد الأدنى من طاقة الليزر. اضبط المستوى البؤري على 15 ميكرون تحت السطح المقطوع لتجنب التسجيل من الخلايا التي يحتمل أن تكون تالفة والحصول على الصور.ضبط تردد أخذ العينات على واحد إلى هيرتز للسماح بالكشف الأولي عن التذبذبات الفردية وتسجيل صورة عالية الدقة. إذا كان ذلك متاحا، استخدم مخططا عبر الإنترنت للحصول على ملاحظات فورية حول استجابة التحضير، والإضاءة الزائدة، والتبييض الضوئي، والانجراف الميكانيكي. عند الحصول على جميع الصور، احفظ البيانات لتحليلها لاحقا.هنا يمكن ملاحظة مثال على شريحة الأنسجة المثلى التي تم فيها تحميل صبغة مؤشر الكالسيوم القابلة للنفاذ إلى الخلية بنجاح في شريحة أنسجة البنكرياس. في المقابل ، فإن شرائح الأنسجة هذه ليست مثالية للتصوير إما بسبب اختراق الصبغة غير الناجح ، أو نقص الخلايا الجزرية ، أو وفرة الأنسجة الميتة على سطح العينات. يمكن استخدام صور عالية الدقة لشريحة أنسجة البنكرياس لتحديد مناطق متميزة من أنسجة البنكرياس ، مثل جزر لانغرهانز أو أنسجة الأسينار أو قناة البنكرياس.يمكن استخدام المحفزات للتمييز وظيفيا بين الخلايا الجزرية المختلفة أو بين الخلايا الجزرية وغير الجزرية. على سبيل المثال، تستجيب خلايا بيتا عادة لتحفيز الجلوكوز النبضي المربع من خلال إظهار زيادة عابرة في الكالسيوم داخل الخلايا تليها تذبذبات الكالسيوم السريعة على هضبة مستدامة. في المقابل، تستجيب الخلايا غير بيتا بتذبذبات أسرع وأكثر انتظاما.يمكن أيضا قياس التأخير في ظهور زيادة الكالسيوم داخل الخلايا بعد التحفيز ، وكذلك عدم التجانس والتأخير بين الخلايا الفردية. يمكن استخدام نفس المعلمات لوصف مرحلة إلغاء التنشيط. هنا يمكن ملاحظة عرض تخطيطي لمدة تذبذب الكالسيوم داخل الخلايا وتواترها والنسبة المئوية للوقت النشط.عند التصوير بمعدلات اكتساب أكبر من 10 هرتز ، يمكن التعرف بوضوح على موجات الكالسيوم التي تنتشر بشكل متكرر عبر الجزيرة. قم بتثبيت القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من الاثني عشر قدر الإمكان لمنع انسداد الفرع الذي يدخل البنكرياس عن طريق الخطأ. أيضا ، لا تتوقف عن اكتئاب المكبس أثناء الحقن لأن الأغاروز سوف يتصلب على الفور في الإبرة.يمكن أيضا استخدام تقنية شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفأر مع طريقة مشبك التصحيح لدراسة تيارات القناة الأيونية والوصول إلى الخلايا وكذلك دراسات الكيمياء النسيجية المناعية ودراسات السكرتارية.