Det arbete som presenterades i denna studie stöddes ekonomiskt av den slovenska forskningsbyrån (forskningsmaterial. P3-0396 och I0-0029, samt forskningsprojekt nr. J3-9289, N3-0048 och N3-0133) och av den österrikiska vetenskapsfonden / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterala bidrag I3562--B27 och I4319--B30). Vi tackar Maruša Rošer, Maša Čater och Rudi Mlakar för utmärkt tekniskt bistånd.

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiellt eller ekonomiskt intresse.

Pankreasvävnadsskivandemetoden är en snabb experimentell metod för att studera morfologin och fysiologin hos de endokrina och exokrina delarna av bukspottkörteln i en mer konserverad, in situ-beredning. Många av fördelarna har redan påpekats i inledningen. Det är värt att påpeka att i allmänhet (dvs. inte bara för kalciumavbildning) sparar skivmetoden för att studera bukspottkörtelfysiologi tid eftersom det inte innebär en återhämtningsperiod efter isolering. Det senare är inte absolut nödvändigt med alla typer av experiment och användning av isolerade öar från olika arter, men används vanligtvis för att öka renheten, återställa livskraften och funktionaliteten och ibland för att samla holmar från flera givare 59,60,61,62,63,64 . I samband med kalciumavbildning har dock betacellsvar visat sig bero på odlingens varaktighet och förhållanden, och detta är en viktig källa till variation som bör beaktas vid användning av isolerade öar15,65. Samma fråga bör övervägas för vävnadsskivor om deras långsiktiga odling blir ett allmänt använt alternativ i framtiden22,36. Vävnadsskivarmetoden har också ett högt utbyte och minskar därmed potentiellt djurens lidande och ökar statistisk kraft. Dessutom kan så många skivor framställas från ett enda djur och eftersom skivorna överlever under långa perioder blir det möjligt att inkludera samma djur eller till och med samma ö i både experiment- och kontrollgrupperna.
Eftersom den ursprungliga arkitekturen och cell-till-cell-kommunikationen bevaras, och eftersom den är kompatibel med ett antal strukturella analyser, elektrofysiologiska, avbildningsmetoder och hormonsekretionsanalyser, är denna metod särskilt användbar för att studera bukspottkörtelfunktioner som är beroende av ostörda interaktioner mellan enskilda celler, t.ex. känslighet för sekretagoger, parakrin och immuninteraktioner mellan olika celltyper, mönster av elektrisk aktivitet, egenskaper hos kalciumdynamik och utsöndring av olika hormoner. För kalciumavbildning specifikt är de främsta fördelarna med att använda skivor exponeringen av ökärnan och möjligheten att förvärva signaler från många olika celltyper med hög upplösning. Beroende på experimentets krav och djurens ålder kan tjockleken varieras, skivorna kan transfekteras eller erhållas från djur med genetiskt kodade reportrar. Som förklaras mer detaljerat nedan möjliggör de två senare metoderna också specifik funktionell identifiering och karakterisering av svar från icke-betaceller 31,66. Dessutom kan öar från väldefinierade delar av organet studeras för skillnader i lyhördhet eller mottaglighet för sjukdom. Även om de inte kräver en återhämtningsinkubationsperiod kan de lätt inkuberas med olika farmakologiska medel, fettsyror, hög glukos och cytokiner.
Viktigast av allt, eftersom hög upplösning kan uppnås i kombination med encellig eller till och med subcellulär upplösning, är konfokal kalciumavbildning i skivor en av de mest lämpliga metoderna för att analysera kalciumvågor, funktionell anslutning och de olika funktionella rollerna hos celler i distinkta delar av en holme54,67. Trots ett antal fördelar har vävnadsskivametoden viktiga begränsningar. För det första är det fortfarande åtminstone delvis störande för ö- och exokrin arkitektur, särskilt vid skärytan, och försiktighetsåtgärder, såsom låg temperatur, frekvent utbyte av lösningar och mild och snabb manipulation, behövs under beredningen för att förhindra ytterligare mekanisk och endogen enzymatisk skada. För det andra är mönstren för leverans av näringsämnen och sekretagog fortfarande sämre än in vivo-vägen, preparatet är fristående från systemisk innervation och återkoppling mellan organ, såsom mellan holmen och dess målvävnader, är omöjlig, i motsats till in vivo-tillvägagångssätt. För det tredje begränsas maximal skivtjocklek av syresättning, näringstillförsel och pH-reglering vid ~ 200 μm9. Vidare kräver både beredning av skivor och avbildning mycket träning, och djupgående analyser av kalciumdata från långa tidsserier och från många celler kräver specialkunskaper som ofta inte ingår i en klassisk fysiologs verktygslåda och kräver hjälp från fysiker eller datavetare. Fördelen att homo- och heterotypiska interaktioner bevaras kan också komplicera analysen av prover på grund av närvaron av signaler från andra celler i regioner av intresse. Beroende på protokoll kan aktivering av andra celler leda till indirekt ytterligare stimulering eller hämning av en observerad cell.
Detta kan endast lösas slutgiltigt genom dekonvolutionsmetoder, genom mer komplexa stimuleringsprotokoll inklusive ämnen som blockerar några av de indirekta effekterna, genom att använda specifika knock-out-djur och genom noggrann jämförelse av resultat med resultat från andra studier som använder mer reduktionistiska metoder. Dessutom, om sekretionsmätningar är nödvändiga, bör man komma ihåg att vissa skivor kan sakna öar, och den totala massan av endokrin vävnad i en enda skiva är vanligtvis låg. Förberedelsen av akuta bukspottkörtelvävnadsskivor för avbildning innefattar flera kritiska steg som diskuteras i följande avsnitt och sammanfattas i tabell 1, där läsaren också kan hitta korta men viktiga tips för felsökning. Först, vid beredning av agaroslösningen, måste agarospulvret lösas upp helt, annars kan de oupplösta partiklarna hindra injektionen. Håll den homogena agaroslösningen vid 37-45 °C för att förhindra härdning av agaros på grund av för låg temperatur å ena sidan och för att förhindra vävnadsskador på grund av för höga temperaturer å andra sidan. Efter användning kan den återstående agarosen förvaras vid 4 °C och värmas upp igen, även om upprepad uppvärmning kan leda till ökad densitet på grund av vattenavdunstning, vilket så småningom gör injektionen svår eller omöjlig.
Nästa kritiska steg i beredningen är att klämma fast den stora duodenala papillen korrekt. En vit fläck på tolvfingertarmen indikerar korsningen mellan den gemensamma gallgången och tolvfingertarmen. En klämma placerad för proximalt kommer att resultera i obstruktion av vissa laterala bukspottkörtelgrenar i den gemensamma kanalen, vilket inaktiverar injektionen av dessa delar, medan en klämma placerad för distalt kommer att resultera i att agaros läcker genom den nedre motståndsvägen direkt in i tolvfingertarmen. Före kannulering av den gemensamma gallgången kan den omgivande fettvävnaden försiktigt avlägsnas för bättre visualisering av kanalen och större kontroll under injektionen. Otillräcklig precision vid avlägsnande av den omgivande vävnaden kan leda till perforering av kanalen. Valet av nåldiametern som används för agarosinjektion är också viktigt. Hos möss används företrädesvis en 30 G nål; mindre (32 eller 33 G) nålar kräver mer ansträngning på grund av agaroslösningens höga viskositet och är mer benägna att obstruktion. Men om de används i kombination med en agaroslösning med lägre densitet kan de vara till stor hjälp i mindre musstammar och yngre djur. Under de första postnatala dagarna kan agaros alternativt injiceras subkapsulärt snarare än intraduktalt2. Att använda nålar med större diameter hos möss kommer troligen att leda till att den gemensamma gallgången skadas. Detta kan också hända med rätt nåldiameter, och en pincett kan hjälpa till att hålla nålen på plats under injektionen. Nålar med större diameter kan vara den enda lösningen vid större kanaler, som finns hos råttor. Om nålen är för smal för att säkerställa en tät tätning som förhindrar ryggläckage, kan en ligatur placeras runt den vid framgångsrikt inträde i kanalen.
Agarosinjektion tar lite ansträngning på grund av lösningens viskositet, och när injektionsprocessen har startat bör den inte avbrytas eftersom agaroslösningen med låg smältpunkt kan stelna i nålen eller de största delarna av duktalträdet innan injektionen är klar. Detta kommer att resultera i dålig vävnadspenetration och sämre stöd under skärning. Kanalen ska alltid kannuleras vid den punkt där den vänstra leverkanalen och den cystiska kanalen går samman för att bilda den gemensamma gallgången.. Om den gemensamma gallgången blir perforerad, försök upprepade gånger att kannulera närmare tolvfingertarmen. När bukspottkörteln är tillräckligt stabiliserad med agaroslösning och extraheras från bukhålan skärs små bitar av välinsprutad vävnad. Innan du bäddar in dem i agarosen är det viktigt att ta bort alla fett- och bindväv eftersom deras rester gör skivning mer utmanande. Detsamma gäller blodkärl och kanalrester, förutom när de är i fokus för experimentet. I det här fallet, se till att placera dem på ett sådant sätt att önskat tvärsnitt kommer att erhållas. När du bäddar in vävnaden i agaros, se till att temperaturen är lämplig (37 °C) och att vävnaden är helt omgiven av agaros, eftersom krafter under vibratomskärning kan slita ut bukspottkörtelvävnaden från agarosblocken.
Att snabbt torka vävnadsblocken innan du placerar dem i agaros genom att placera dem kort på en pappersvävnad kan hjälpa till att förhindra dålig kontakt mellan vävnad och agaros under detta steg. Under stelning av agarosblock, placera petriskålen horisontellt och förhindra kontakt mellan bukspottkörtelvävnaden och botten av petriskålen. Om bukspottkörteln inte är helt injicerad kommer skärprocessen att vara utmanande. Försök därför att minska skärhastigheten för att få vävnadsskivor. För att minimera cellskador under vibrationsskivning, byt ut ECS (och isbitarna gjorda av ECS) i skivkammaren regelbundet. Den senare kommer att minska aktiviteten hos pankreasenzymer som frigörs från acinär vävnad under skivning. Skivornas tjocklek är också av avgörande betydelse. För kalciumdynamik och elektrofysiologiska experiment skärs vanligtvis 140 μm skivor; Enligt syftet med studien kan dock skivtjockleken sträcka sig från 90 μm till 200 μm. Tänk på att i tjockare skivor kommer diffusionen av syre och näringsämnen att begränsas, men de kommer att innehålla mer vävnad. Dessutom kan andelen oklippta holmar förväntas öka med ökande skivtjocklek. Skivor kan förvaras i ett regelbundet utbytt ECS vid rumstemperatur i flera timmar eller till och med odlas i ett lämpligt cellmedium i flera dagar; detta kan dock så småningom påverka den normala öcellsfysiologin 3,22.
När du förbereder färglösningen, se till att alla komponenter blandas noggrant och undvik exponering för omgivande ljus. Bukspottkörtelskivan består av många cellskikt, och upptaget av kalciumfärgämne är begränsat till de första mest ytliga cellskikten, som beskrivits tidigare för isolerade öar58,68 och hypofysskivor69. Men i motsats till isolerade öar där den omgivande kapseln och de yttre cellskikten hindrar färgämnets penetration i djupare lager, tillåter vävnadsskivor tillgång till hela tvärsnittsytan på ön, vilket möjliggör samtidig mätning av kalciumdynamiken i hundratals celler från alla lager av en ö. Fluorescerande Ca2+ indikatorer är de mest använda för att mäta kalciumdynamik, och tillsammans med CLSM möjliggör de inspelningar med hög tidsupplösning och når flera hundra Hertz. När du väljer den lämpligaste fluorescerande Ca2+ -indikatorn, överväga olika faktorer, inklusive indikatorformen, som påverkar cellbelastningsmetoden, mätläget (kvalitativt eller kvantitativt) och dissociationskonstanten (Kd) som måste ligga i ca2+ koncentrationsintervallet av intresse och beror på pH, temperatur, närvaro av Mg2+ och andra joner, samt proteinbindning. Eftersom cellulära Ca2+ signaler vanligtvis är övergående bör Ca2+ bindningshastighetskonstanten också övervägas. För att mäta [Ca2+]IC-dynamik i bukspottkörtelceller använder denna grupp huvudsakligen det cellgenomsläppliga Ca2+ indikatorfärgämnet som beskrivs i detta protokoll (Materialtabell) eftersom det är en lång våglängdsindikator med emissionsvåglängderna i spektrumet där cellulär autofluorescens vanligtvis är mindre problematisk och energin i excitationsljus är låg, vilket minskar risken för cellulära fotoskador. Eftersom detta färgämne är fluorescerande vid låga Ca2+ koncentrationer, underlättar detta bestämningen av baslinjen [Ca2+] IC och ökar cellulär synlighet före stimulering. Efter bindning av Ca2+ ökar färgämnets fluorescensintensitet 14 gånger, vilket möjliggör detektering av även små förändringar i [Ca2+]IC.
För framgångsrik kalciumavbildning av levande celler måste flera viktiga hårdvaruparametrar beaktas, som beskrivs i protokollavsnittet. För levande cellavbildning där signalamplituderna är låga och risken för fototoxicitet är hög, används mål med högre NA företrädesvis för att samla in mer ljus från provet. Om kalciumdynamik måste registreras med en hög tidsupplösning, använd resonansskannern istället för linjära galvanometrar. Förutom att välja rätt mål undviker användningen av mycket känsliga detektorer - som hybriddetektorer som kräver mindre laserkraft - fototoxicitet och fotoblekning. Detta är av särskild betydelse för långvarig kalciumavbildning. Andra viktiga steg i kalciumavbildning är parameterinställningar för bildkvalitet för tidsserieförvärv. De viktigaste är den tidsmässiga och den rumsliga upplösningen. Eftersom kalciumdynamiken i sig bestämmer den lägsta acceptabla tidsupplösningen måste samplingsfrekvensen vara minst två gånger högre än den förväntade signalfrekvensen för att detektera signalen eller till och med 10 gånger högre för att detektera signalens form på ett tillförlitligt sätt. Vid akuta bukspottkörtelvävnadsskivor kan kalciumdynamiken mätas i hundratals celler samtidigt och därför är den rumsliga upplösningen också viktig. Detta kan förbättras genom att öka antalet pixlar eller genom att öka linjens medelvärde under liveförvärv. Men på grund av det omvända förhållandet mellan den rumsliga och den tidsmässiga upplösningen behövs en avvägning mellan båda inställningarna.
Om kalciumavbildning måste utföras i en specifik cellpopulation i bukspottkörteln är en stimulans som funktionellt kan differentiera cellerna i skivan nödvändig. Hög glukos aktiverar pålitligt och snabbt betaceller till ett oscillerande mönster som läggs på en förhöjd kalciumnivå och är mycket synkroniserad mellan alla celler inom en ö 32,58,70. Betacellerna är den mest talrika celltypen inom en holme och ligger mestadels i ökärnan hos möss. Samma stimuleringsprotokoll minskar och förändrar ibland inte märkbart sprängningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. För att diskriminera alfaceller funktionellt kan låg (3 mM) glukos, glutamat eller adrenalin användas för att öka deras frekvens eller basala [Ca2+] IC 21,72,73,74,75. De representerar 10-20% av öcellerna och kommer att detekteras på öns periferi1. Deltaceller finns också i periferin. De utgör endast ~ 5% av det totala antalet endokrina celler i en ö och är vanligtvis aktiva i 6 mM glukos och svarar på glukosstimulering med en ökad oregelbunden sprängaktivitet från baslinjen eller en något förhöjd kalciumnivå 1,32,71,76. Ghrelin kan användas för specifik stimulering av deltaceller 21,77,78,79 i kalciumavbildningsexperiment. Protokoll för specifik funktionell identifiering av PP- och epsilonceller återstår dock att definiera. Vidare aktiverar 25 nM acetylkolin på ett tillförlitligt sätt acinarceller till sprängaktivitet 35,80,81. Dessutom kan ett antal andra sekretagoger, såsom cerulein, cholecystokinin och karbamylkolin, användas för att framkalla kalciumsvar i acinarceller 22,40,82,83.
Slutligen framkallar 1 mM kenodeoxicholsyra på ett tillförlitligt sätt kalciumsvar i duktala celler i vävnadsskivor; angiotensin II, ATP och några andra sekretagoger kan också användas 11,23,84,85. När en funktionell identifiering baserad på karakteristiska svar på specifika sekretagoger och hämmare inte är tillräcklig kan genetiskt märkta djur31, transfekterade celler73 eller immunocytokemi användas för identifiering av olika celltyper 9,22,71,86 . Under de senaste åren har vävnadsskiva-metoden framgångsrikt anpassats till mänsklig vävnad och öppnat många nya viktiga forskningsvägar inom både exokrin41 och endokrin fysiologi 9,36,37,39. Intressant nog har en detaljerad bedömning av kalciumdynamiken i mänskliga öar varit notoriskt svår och återstår att undersöka mer detaljerat87. I kombination med avancerad konfokalmikroskopi har bukspottkörtelvävnadsskiva-metoden möjliggjort många nya insikter om kalciumdynamiken hos möss och kommer förhoppningsvis att göra detsamma för mänsklig vävnad.

Däggdjurets bukspottkörtel är en stor exokrin och endokrin körtel. Den exokrina delen utgör 96-99% av den totala bukspottkörtelvolymen och består av acini och kanaler. Den endokrina delen består av ett stort antal langerhanska öar som står för de återstående 1-4% av den totala bukspottkörtelvolymen1. Den exokrina delen utsöndrar stora matsmältningsenzymer som bryter ner energirika polymerer i mat, liksom en bikarbonatrik vätska, som kombineras med andra gastrointestinala sekret för att ge en miljö som är lämplig för enzymernas verkan. Den endokrina delen utsöndrar hormoner som reglerar postprandial distribution, lagring och interprandial frisättning av energirika näringsämnen. Även om den exokrina vävnaden är relativt underutvecklad och den endokrina relativt välutvecklad vid födseln, växer den förra snabbt över den senare vid avvänjning 2,3,4. Tidiga studier av bukspottkörtelfunktionen markerade födelsen av modern fysiologi, och stora metodologiska framsteg inom området har följts av stora vetenskapliga genombrott5. Att arbeta med bukspottkörteln är tekniskt utmanande på grund av körtelns invecklade struktur, men är också en stor motivation på grund av sjukdomar som bukspottkörtelcancer, pankreatit och diabetes som utgör stora hot mot folkhälsan och för vilka nya terapeutiska metoder behövs.
Isolerade öar6, acini 7,8 och duktalt fragment hade utvecklats och använts i årtionden som guldstandardmetoder på grund av deras fördelar jämfört med cellinjer och primära dispergerade endokrina, acinära och duktala celler 9,10. Trots den markant förbättrade funktionen hos isolerade cellkollektiv involverar dessa metoder fortfarande betydande mekanisk och enzymatisk stress, isolerar celler från den omgivande vävnaden och saknar därmed parakrina interaktioner och mekaniskt stöd, och viktigast av allt, åtföljs av signifikanta förändringar i normal fysiologi 11,12,13 . Den akuta muspankreasvävnadsskivan utvecklades 2001 av ett upplevt behov av att utveckla en experimentell plattform som liknar hjärn-, hypofys- och binjureskivor med bevarade intercellulära kontakter, parakrina interaktioner, mesenkym och vävnadsarkitektur, liksom utan några av de viktigaste bristerna i guldstandardmetoden i öforskning av den tiden - de isolerade öarna12, 14. Bland dessa brister finns skador på de yttersta skikten, bristande tillgänglighet till kärnöar och behovet av odling med möjligen viktiga effekter på cellidentitet och fysiologi12,15. Dessutom möjliggör vävnadsskiva-metoden studier på djurmodeller med grovt rubbad öarkitektur där det är omöjligt att isolera öar, eller när öutbytet är extremt lågt genom traditionell isolering 16,17,18,19,20,21.
Dessutom är skivan mer lämplig för att studera morfologiska förändringar under utvecklingen av diabetes och pankreatit, till exempel, eftersom den möjliggör en bättre översikt över hela vävnaden och också är kompatibel med att studera regionala skillnader. Viktigt, trots det tidiga fokuset på den endokrina delen, möjliggör vävnadsskiva-metoden i sig studier av de exokrina komponenterna 9,22,23. Under det första decenniet efter introduktionen användes metoden för elektrofysiologiska studier av beta 14,24,25,26,27,28,29 och alfa 30,31 celler samt för att undersöka den morfologiska och funktionella mognaden av bukspottkörteln 2,3 . Ett decennium senare 2013 anpassades metoden framgångsrikt för levande cellkalciumavbildning av öceller med hjälp av CLSM för att karakterisera deras svar på glukos32, deras funktionella anslutningsmönster33 och förhållandet mellan membranpotential och intracellulärt kalcium genom att kombinera ett fluorescerande kalciumfärgämne med ett membranpotentialfärgämne34. Senare samma år användes metoden också för att bedöma kalciumdynamiken i acinarceller22,35. Under de följande åren har bukspottkörtelvävnadsskivor använts i ett antal olika studier och framgångsrikt anpassats till gris och mänsklig vävnad 9,36,37,38,39,40,41. Sammantaget utförs dock kalciumavbildning - i mus bukspottkörtelvävnadsskivor i allmänhet och på öar i synnerhet - fortfarande mestadels av denna grupp. En av de främsta orsakerna till detta kan ligga i kombinationen av ett tekniskt utmanande vävnadsskivapreparat, behovet av ett konfokalmikroskop och ganska komplex dataanalys. Huvudsyftet med detta dokument är att göra denna kraftfulla metod mer tillgänglig för andra potentiella användare.
Det finns redan några utmärkta metodologiska artiklar som i detalj behandlar vävnadsskivaberedning och användning av skivor för struktur- och utsöndringsstudier, men inte för konfokal kalciumavbildning 9,42,43. Därför fokuserar detta papper på några ytterligare tips och tricks under beredningen av skivor, på steg som är kritiska för framgångsrik färgladdning, bildförvärv samt på de viktigaste stegen i grundläggande kalciumdataanalys. Detta bidrag bör därför ses som ett komplement till snarare än som ett alternativ till ovannämnda metod. På samma sätt ska kalciumavbildning i musvävnadsskivor för bukspottkörtelvävnad ses som ett experimentellt tillvägagångssätt som ska användas för att besvara specifika frågor och är därmed ett komplement till snarare än ett absolut alternativ för andra kalciumavbildningsmetoder inom bukspottkörtelfysiologi, såsom isolerade kanaler eller acini, isolerade öar, organoider, öar som transplanterats in i ögats främre kammare. och inspelningar in vivo 11,44,45,46,47,48. Löftet om kalciumavbildning i mus bukspottkörtelvävnadsskivor illustreras förmodligen bäst av nyligen framgångsrika inspelningar av kalciumdynamik i ö-mesenkymala celler som pericyter49 och makrofager50, liksom i duktala celler23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

Den akuta muspankreasvävnadsskivan är ett unikt in situ-preparat med bevarad intercellulär kommunikation och vävnadsarkitektur som medför betydligt färre beredningsinducerade förändringar än isolerade öar, acini, kanaler eller dispergerade celler som beskrivs i typiska in vitro-studier. Genom att kombinera den akuta bukspottkörtelvävnadsskivan med levande cellkalciumavbildning i konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) kan kalciumsignaler studeras i ett stort antal endokrina och exokrina celler samtidigt, med en encellig eller till och med subcellulär upplösning. Känsligheten möjliggör detektering av förändringar och möjliggör studier av intercellulära vågor och funktionell anslutning samt studier av beroendet av fysiologiska svar hos celler på deras lokalisering inom ö- och parakrinförhållandet med andra celler. Slutligen, ur ett djurskyddsperspektiv, minskar registrering av signaler från ett stort antal celler åt gången antalet djur som krävs i experiment, vilket bidrar till 3R-ersättning, minskning och förfining-principen.

Injektionen av agaroslösningen i bukspottkörtelkanalen är det mest kritiska steget i beredning av bukspottkörtelvävnadsskivor. En framgångsrik injektion kan kännas igen genom en blekning av bukspottkörtelvävnaden, som ses på vänster sida av figur 3A, medan en ofullständigt injicerad del av bukspottkörteln presenteras på höger sida av figur 3A. Langerhanska öar kan kännas igen med blotta ögat eller under ett stereomikroskop, och detta hjälper till att skära lämpliga delar av bukspottkörteln för efterföljande inbäddning i agarosblock (figur 3B). I en nyskuren mus bukspottkörtelvävnadsskiva kan langerhanska öar lätt särskiljas från den omgivande exokrina vävnaden och mesenkymen som vita fläckar under stereomikroskopet (figur 3C) eller som brunaktiga strukturer under ljusmikroskopet (figur 3D). Bukspottkörtelvävnadsskivorna kan användas för olika typer av experiment i minst 12 timmar efter skivning. Förutom den grova morfologiska bedömningen under stereomikroskopet, ljusmikroskopet och cellernas funktionella svar under kalciumavbildning kan livskraften hos bukspottkörtelvävnadsskivorna bedömas (Figur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figur 4: Viabilitet av celler i vävnadsskivan. Cellernas livskraft bestämdes med live/dead-analysen. Levande celler färgas av Calcein AM (visas i grönt), medan döda celler färgas med etidiumhomodimomer-1 (visas i rött). Gula linjer anger positionen för X-Y-tvärsnittet av Z-stacken som visas längst ner och till höger. Z-stackens fulla djup är 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
För kalciumavbildningsexperiment måste den fluorescerande kalciumindikatorn tränga igenom några lager av celler. Figur 5A visar framgångsrik laddning av det cellgenomsläppliga Ca2+ indikatorfärgämnet i bukspottkörtelvävnadsskivan där enskilda öar och acinarceller kan kännas igen. Däremot är skivor i figur 5B-D inte optimala på grund av misslyckad penetrering av färgämnet (figur 5B), brist på öceller (figur 5C) och mycket nekrotisk vävnad på ytan (figur 5D). Sådana skivor kan kasseras, kontrolleras för förekomst av ytterligare öar som skärs eller färgas bättre (se tabell 1 för felsökning) eller användas för att registrera svaren från exokrina celler.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figur 5: Exempel på användbara och oanvändbara preparat. (B) Ett exempel på en dåligt färgad vävnadsskiva. (C) Exempel på en holme Langerhans med strukturella avbrott. (D) Ett exempel på en holme Langerhans som innehåller många döda celler och mycket skräp. Uppslagstabellen "glow-over, glow-under" till höger visar 0 intensitet i grönt och mättnad i blått. Skalstreck = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Representativa resultat från kalciumavbildning med hjälp av det cellgenomsläppliga Ca2+ indikatorfärgämnet visas i figur 6. I figur 6A presenteras en högupplöst bild av en bukspottkörtelvävnadsskiva som innehåller en ö av Langerhans, acinär vävnad och en bukspottkörtelkanal. För bättre distinktion är den endokrina, exokrina och duktiga delen av bukspottkörtelvävnadsskivan som presenteras i figur 6A färgade i figur 6B. Att använda lämpliga stimuli kan funktionellt skilja mellan olika öceller, eller ö- och icke-öceller51. Betaceller svarar vanligtvis på en fyrkantig pulsstimulering av glukos med en övergående ökning av [Ca2+] IC följt av snabba kalciumoscillationer på en ihållande platå (figur 6C, övre panelen).
Eftersom alla betaceller är kopplade till ett enda, stort, funktionellt syncytium, är dessa svängningar också mycket väl synkroniserade mellan olika celler genom att sprida [Ca2+]IC-vågor 32,34,52,53,54 (Figur 7C). Långsammare [Ca2+]IC-svängningar med en period på 5-15 minuter kan ligga till grund för de snabba svängningarna eller till och med vara den dominerande typen av reponse55,56. Samma enkla protokoll kan avslöja andra typer av svar, särskilt i periferin av öar (figur 6C, nedre panelen). Eftersom dessa celler inte synkroniseras med betaceller och svarar med snabbare och mer oregelbundna svängningar som redan finns i låga glukosförhållanden eller med minskad aktivitet, tyder sådana svar starkt på icke-betaceller 21,32,57,58. Men deras definitiva funktionella karakterisering kräver mer komplexa protokoll med ytterligare stimuleringssteg eller alternativa tillvägagångssätt, som diskuteras nedan. Typiska svar från acinära och duktala celler presenteras i figur 6D respektive figur 6E. Se litteraturen för mer information om acinar och duktala celler 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figur 6: Representativa resultat av kalciumdynamik i olika typer av bukspottkörtelceller. Skalstreck = 100 μm. (B) Avgränsning av distinkta delar av bukspottkörtelvävnad med acinär vävnad som visas i gult, en ö langerhans som visas i rött och ett segment av duktalträdet i blått. Skalstång = 100 μm. (C) Typiska spår av kalciumdynamik i beta- och förmodade icke-betaceller under stimulering med 12 mM glukos; 3 mM glukos användes för icke-stimulerande tillstånd. Protokoll som kan användas för mer specifik diskriminering av icke-betaceller beskrivs i diskussionsavsnittet. (D) Ett typiskt spår av kalciumdynamiken i acinarceller stimuleras av 25 nM acetylkolin. (E) Ett typiskt spår av kalciumdynamiken hos duktala celler stimulerad av 1 mM kenodeoxicholsyra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Efter framgångsrik kalciumavbildning exporteras och korrigeras data först för blekning genom en kombination av en exponentiell och linjär passform, som beskrivs i protokollavsnittet. En tidsserie före och efter blekningskorrigering presenteras i figur 7A. Därefter kan flera parametrar i aktiverings- och avaktiveringsfasen av svaret samt platåfasen analyseras. En fördröjning i början av [Ca2+]IC-ökning efter stimulering kan mätas som representerad av fördröjningA i figur 7B och heterogeniteten i fördröjningar mellan enskilda celler (fördröjningA1). Samma parametrar (fördröjningD och fördröjningD1) kan användas för att beskriva avaktiveringsfasen. Efter den initiala övergående [Ca2+]IC-ökningen kännetecknas platåfasen i de flesta betaceller i bukspottkörteln i en ö av relativt regelbundna högfrekventa [Ca2+]IC-svängningar . Platåfasen kan beskrivas genom att analysera de klassiska funktionella parametrarna. Den schematiska presentationen av [Ca2+]IC-svängningar varaktighet, frekvens och procentandel av aktiv tid presenteras i figur 7C. Vid kalciumavbildning med förvärvshastigheter högre än 10 Hz kan kalciumvågor som upprepade gånger sprider sig över holmen också kännas igen tydligt (figur 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figur 7: Analys av tidsseriedata. (B) Analys av fördröjningar av aktivering efter stimulering och avaktivering efter upphörande av stimulering med 12 mM glukos. Stimuleringens varaktighet betecknas med den ljusgrå, skuggade stapeln i bilden. (C) Analys av flera parametrar i platåfasen: I) Oscillationens varaktighet bestämd vid halvhöjd, II) oscillationsfrekvens bestämd av interoscillationsintervall. III) aktiv tid som en produkt av frekvens och varaktighet av svängningar. I-IV) Fördröjningar mellan svängningar i en given våg av svängningar som sprider sig över Langerhans ö bestämd av förseningarna (Δt) i tid då en enda cell når halvhöjden av oscillationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Vi presenterar beredningen av akuta bukspottkörtelvävnadsskivor och deras användning i konfokal laserscanningsmikroskopi för att studera kalciumdynamik samtidigt i ett stort antal levande celler, under långa tidsperioder och med hög spatiotemporal upplösning.

Konfokal laserscanningsmikroskopi av kalciumdynamik i akuta mus pankreasvävnadsskivor

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

I kombination med levande cellkalciumavbildning möjliggör den akuta bukspottkörtelvävnadsskivastekniken studier av intercellulära vågor och multicellulär funktionell anslutning med hög upplösning under långa tidsperioder. De främsta fördelarna med denna teknik är att den är snabb, bevarar vävnadsarkitekturen och minskar begränsad enzymatisk och mekanisk stress samtidigt som ett högt utbyte av vävnad bibehålls. Genom att upptäcka funktionella och morfologiska förändringar under sjukdomsprogression hjälper denna teknik vår förståelse av bukspottkörtelrelaterade sjukdomar, såsom diabetes.Denna vävnadsskiva teknik kan tillämpas på hjärn-, hypofys- och binjurevävnader med tonvikt på bevarande av intercellulär kontakt, parakrina interaktioner och vävnadsarkitektur. För att förbereda injektion av agaros i musens bukspottkörtel, fyll en fem milliliter spruta med 40 grader Celsius flytande agaros och utrusta sprutan med en 30 gauge nål. Efter att försiktigt ha täckt nålen med ett lock, placera sprutnålens ände nedåt, med hela volymen agaros under vattenytan, i ett 40 grader Celsius vattenbad.Bubbla en flaska extracellulär lösning med karbogen, kontinuerligt på is, vid 1,5 ml per minut vid barometertryck och rumstemperatur för att säkerställa syresättning och ett pH på 7,4. För att utföra agarosinjektionen placera en avlivad vuxen mus under ett stereomikroskop och få tillgång till musens buk via laparotomi. Flytta försiktigt tarmen till vänster sida för att exponera den gemensamma gallgången och använd pincett för att något lyfta kanalens duodenala ände för att lokalisera Vaters papill.Använd en hemostat för att klämma fast gallgången vid duodenalpapillen för att förhindra läckage av agarosen från kanalen till tolvfingertarmen och använd en liten skarp tång för att nå under den gemensamma gallgången för att bryta membranet som fäster kanalen i bukspottkörtelvävnaden. Efter att ha rensat så mycket fett och bindväv från kanalen som möjligt, placera kanalen vinkelrätt på spetsarna på ett par större pincett och tryck ordentligt på sprutkolven, injicera den viskösa flytande agarosen i den proximala änden av den gemensamma gallgången i 20 till 30 sekunder. När vävnaden blir vitaktig och något utspänd, ta bort sprutan och häll långsamt 20 ml av den bubblande iskalla extracellulära lösningen på bukspottkörteln för att kyla vävnaden och härda agarosen.För att förvärva bukspottkörtelvävnadsskivor använd pincett och fina hårda saxar för att försiktigt överföra den agarosinsprutade bukspottkörteln till en 100 millimeter petriskål innehållande 40 ml iskall extracellulär lösning. Virvla skålen för att skölja vävnaden och överföra bukspottkörteln till en andra skål med iskall extracellulär lösning. Använd tången och saxen för att skära den vitaktiga, välinsprutade bukspottkörtelsektionen i upp till sex bitar på 0,1 till 0,2 kubikcentimeter och ta bort eventuell kvarvarande bindväv och fettvävnad från vävnadsbitarna.Placera de rengjorda blocken i en 35 millimeter icke-klibbig botten petriskål som innehåller cirka fem milliliter 40 grader Celsius flytande agaros och lägg omedelbart petriskålen på is. När agarosen har härdat, håll petriskålen upp och ner över locket på en 100 millimeter petriskål och använd ena halvan av ett rakblad för att försiktigt skära i marginalen mellan petriskålens sidovägg och agarosen för att ta bort agarosen från skålen. Använd rakbladet för att skära enskilda kuber, var och en innehållande ett vävnadsblock av agaros, från den frigjorda agarosen och använd cyanoakrylatlim för att fästa blocken på provplattan i ett vibratom.Fyll vibratomets skärkammare med 150 ml iskall extracellulär lösning som kontinuerligt bubblas med karbogen. Skruva fast provplattan på vibratomet och montera ett nytt rakblad. Omge kammaren med is och tillsätt två isbitar med 10 ml volym gjorda med extracellulär lösning kompletterad med sex millimolär glukos.Ställ in skivaren på 0,05 till 1 millimeter per sekund och 70 hertz och börja sedan skiva för att få 140 mikron tjocka agarosskivor med en yta på 20 till 100 kvadratmillimeter. Använd en fin pensel för att försiktigt överföra varje skiva till en 100 millimeters petriskål fylld med 40 millimeter HEPES-buffert kompletterad med sex millimolar glukos. För beredning av kalciumfärgämne, lös upp 50 mikrogram cellgenomsläppligt kalciumindikatorfärgämne, 7,5 mikroliter DMSO och 2,5 mikroliter av poloxamern och 6,667 ml HBS i ett 15 ml skruvlockrör.Använd en pipett för att blanda lösningen noggrant i 20 sekunder innan du sänker röret i en ultraljudsbadkammare och virvlar, var och en i 30 sekunder. Sedan alikvotera 3,333 ml av den resulterande kalciumindikatorfärglösningen i en 5 ml petriskål per 10 skivor vävnad som ska märkas. För färgbelastning, använd en tunn mjuk pensel för att överföra upp till 10 vävnadsskivor till varje skål med färglösning och placera diskarna på en orbitalskakare i 50 minuter vid rumstemperatur och 40 varv per minut skyddad från ljus.Vid slutet av inkubationen överför du upp till 20 färgade skivor till enskilda 60 ml petriskålar fyllda med färgfri HBS. För kalciumavbildning med konfokalmikroskopi välj en 20 eller 25 gånger förstoring och ställ in förvärvsläget till time-lapse-avbildning, pinhålet till 100 till 200 mikron och excitationen och emissionen för fluoroforen som används i experimentet. Montera inspelningskammaren och perfusionssystemet på mikroskopets temperaturstyrda steg och placera inloppet och utloppet på inspelningskammarens bortre kanter.Ställ in inflödes- och utflödeshastigheterna till en till två milliliter per minut. Ställ in temperaturen på överflödssystemet till 37 grader Celsius och initiera överflöd med den icke-stimulerande lösningen. För att registrera vävnadens kalciumdynamik placera en enda vävnadsskiva i inspelningskammaren och immobilisera vävnaden med en U-formad platinavikt med ett spänt nylonnät.Använd alternativet för ljusa fält för att hitta strukturen av intresse och använd levande avbildning för att placera de studerade strukturerna i synfältet. För att optimera signal-brusförhållandet, justera lasereffekten, detektorförstärkningen och linjegenomsnittet binning samtidigt som lasereffekten hålls minimal. Justera fokalplanet till 15 mikron under snittytan för att undvika inspelning från potentiellt skadade celler och få bilderna.Ställa in samplingsfrekvensen till en till två hertz för att möjliggöra initial detektering av enskilda svängningar och spela in en högupplöst bild. Om det är tillgängligt, använd ett online-diagram för att få omedelbar feedback om förberedelsesvaret, överbelysning, fotoblekning och mekanisk drift. När alla bilder har hämtats sparar du data för senare analys.Här kan ett exempel på en optimal vävnadsskiva observeras där cellgenomsläppligt kalciumindikatorfärgämne framgångsrikt laddades i bukspottkörtelvävnadsskivan. Däremot är dessa vävnadsskivor inte optimala för avbildning på grund av antingen en misslyckad färgpenetration, brist på öceller eller ett överflöd av nekrotisk vävnad på provytan. Högupplösta bilder av en bukspottkörtelvävnadsskiva kan användas för att avgränsa distinkta regioner i bukspottkörtelvävnaden, såsom Langerhans öar, acinär vävnad eller bukspottkörtelkanalen.Stimuli kan användas för att funktionellt skilja mellan olika öceller eller mellan ö- och icke-ö-celler. Till exempel svarar betaceller vanligtvis på en fyrkantig pulsglukosstimulering genom att uppvisa en övergående ökning av intracellulärt kalcium följt av en snabb kalciumoscillation på en ihållande platå. Däremot svarar icke-betaceller med snabbare och mer oregelbundna svängningar.En fördröjning i början av intracellulär kalciumökning efter stimulering, liksom heterogeniteten och förseningarna bland enskilda celler kan också mätas. Samma parametrar kan användas för att beskriva avaktiveringsfasen. Här kan en schematisk presentation av den intracellulära kalciumoscillationens varaktighet, frekvens och procentandel av aktiv tid observeras.Vid avbildning vid förvärvshastigheter större än 10 hertz kan kalciumvågor som upprepade gånger sprider sig över holmen tydligt kännas igen. Kläm fast den gemensamma gallgången så nära tolvfingertarmen som möjligt för att förhindra att grenen som kommer in i bukspottkörteln av misstag täpps till. Sluta inte heller trycka ner kolven under injektionen eftersom agarosen omedelbart härdar i nålen.Den akuta muspankreasvävnadsskiva tekniken kan också användas med patch clamp-metoden för att studera jonkanalströmmar och få tillgång till cytos samt immunohistokemistudier och sekreterarstudier.