Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Die Entwicklung von Wirbeltierenaugen ist ein komplexer Prozess, der gegen Ende der Embryogastrulation beginnt und die präzise Koordination der Zellmigration, -proliferation und -differenzierung erfordert. Die Zeitraffer-Bildgebung bietet einzigartige Einblicke in das Verhalten von Zellen während der Augenentwicklung, da sie es uns ermöglicht, die Okulogenese in vivo zu visualisieren. Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess aufgrund ihres hochgradig konservierten Wirbeltierauges und ihrer Fähigkeit, sich schnell und extern zu entwickeln und gleichzeitig optisch transparent zu bleiben, zu visualisieren. Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischaugen werden durch die Verwendung der transgenen Zebrafischlinie Tg(rx3:GFP) erheblich erleichtert. Im sich entwickelnden Vorderhirn markiert die rx3: GFP-Expression die Zellen des einzelnen Augenfeldes, und GFP wird weiterhin exprimiert, wenn das Augenfeld evaginatiert, um ein optisches Vesikel zu bilden, das dann invaginiert, um eine optische Tasse zu bilden. Die hochauflösende Zeitrafferbildgebung der rx3: GFP-Expression ermöglicht es uns daher, das Augenprimordium durch die Zeit zu verfolgen, während es sich zur Netzhaut entwickelt. Die Lightsheet-Mikroskopie ist eine ideale Methode, um die okuläre Morphogenese im Laufe der Zeit abzubilden, da sie dickere Proben für die Fluoreszenzbildgebung durchdringen, Photobleichen und Phototoxizität minimieren und mit hoher Geschwindigkeit abbilden kann. Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von Bildanalysesoftware. Der resultierende Datensatz kann wertvolle Einblicke in den Prozess der Augenmorphogenese sowie in Störungen dieses Prozesses infolge genetischer Mutationen, Exposition gegenüber pharmakologischen Agenzien oder anderen experimentellen Manipulationen liefern.