Visualisering av okulär morfogenes med Lightsheet-mikroskopi med rx3: GFP Transgenic Zebrafish

Utveckling av ryggradsdjurs ögon är en komplex process som börjar nära slutet av embryogastrulationen och kräver exakt samordning av cellmigration, spridning och differentiering. Time-lapse-föreställning ger unik inblick i cellernas beteende under ögonutveckling eftersom det gör att vi kan visualisera okulogenes in vivo. Zebrafiskar är en utmärkt modell för att visualisera denna process på grund av deras mycket bevarade ryggradsdjursöga och deras förmåga att utvecklas snabbt och externt samtidigt som de förblir optiskt transparenta. Time-lapse-avbildningsstudier av zebrafiskögonutveckling underlättas avsevärt genom användning av den transgena zebrafisklinjen Tg (rx3: GFP). I den utvecklande framhjärnan markerar rx3: GFP-uttrycket cellerna i det enda ögonfältet, och GFP fortsätter att uttryckas som ögonfältet evaginates för att bilda en optisk vesiklar, som sedan invaginates för att bilda en optisk kopp. Högupplöst time lapse-avbildning av rx3: GFP-uttryck tillåter oss därför att spåra ögonprimoret genom tiden när det utvecklas till näthinnan. Ljusarkmikroskopi är en idealisk metod för att avbilda okulär morfogenes över tid på grund av dess förmåga att penetrera tjockare prover för fluorescerande avbildning, minimera fotoblekning och fototoxicitet och bild med hög hastighet. Här tillhandahålls ett protokoll för time-lapse-avbildning av okulär morfogenes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt ljusarkmikroskop och en arbetsstation för bildbehandling för att analysera de resulterande data. Detta protokoll beskriver procedurerna för embryoanestesi, inbäddning i låg smälttemperatur agaros, suspension i bildkammaren, inställning av bildparametrarna och slutligen analys av bilddata med hjälp av bildanalysprogramvara. Den resulterande datasetet kan ge värdefulla insikter i processen med okulär morfogenes, liksom störningar i denna process som ett resultat av genetisk mutation, exponering för farmakologiska medel eller andra experimentella manipulationer.