אנו מכירים בליבת אימונולוגיה אנושית על אספקת תאי T תורמים רגילים ואת ליבת Cytometry הזרימה באוניברסיטת פנסילבניה.

תאי T אנושיים נצברו באמצעות ליבת האימונולוגיה האנושית של אוניברסיטת פנסילבניה, הפועלת תחת עקרונות של תרגול מעבדה טובה עם נהלי הפעלה סטנדרטיים שנקבעו ו / או פרוטוקולים לקבלת מדגם, עיבוד, הקפאה וניתוח התואמים את הנחיות האתיקה של MIATA ואוניברסיטת פנסילבניה.
1. ייצור וקטורי לנטיוו...

<ol>
	<li>Kowolik, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells.">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-dependent+CD28+signaling+selectively+enhances+survival+and+proliferation+in+genetically+modified+activated+human+primary+T+lymphocytes.">Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).</li><li>Kuwana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chimeric+receptor+composed+of+immunoglobulin-derived+V+resions+and+T-cell+receptor-derived+C+regions.">Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions.</a> Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).</li><li>Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivi&#232;re, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T-lymphocyte+cytotoxicity+and+proliferation+directed+by+a+single+chimeric+TCR&#950;/CD28+receptor.">Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCR&#950;/CD28 receptor.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).</li><li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+manufacturing+of+CAR-T+cell+therapy.">Global manufacturing of CAR-T cell therapy.</a> Molecular Therapy-Methods &amp; Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axicabtagene+ciloleucel+CAR-T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma.">Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+and+NK-cell+infiltration+into+solid+tumors:+a+key+limiting+factor+for+efficacious+cancer+immunotherapy.">T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy.</a> Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).</li><li>Mohammed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cell+function+by+reversing+the+immunosuppressive+tumor+microenvironment+of+pancreatic+cancer.">Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer.</a> Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).</li><li>Moon, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifactorial+T-cell+hypofunction+that+is+reversible+can+limit+the+efficacy+of+chimeric+antigen+receptor-transduced+human+T+cells+in+solid+tumors.">Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).</li><li>Beatty, G. L., O'Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+the+treatment+of+solid+tumors:+defining+the+challenges+and+next+steps.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 166, 30-39 (2016).</li><li>Stadtmauer, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-engineered+T+cells+in+patients+with+refractory+cancer.">CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer.</a> Science. 367 (6481), (2020).</li><li>MacLeod, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+CD19+CAR+into+the+TCR+alpha+chain+locus+streamlines+production+of+allogeneic+gene-edited+CAR-T+cells.">Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+editing+to+generate+universal+CAR-T+cells+resistant+to+PD1+inhibition.">Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).</li><li>Ure&#241;a-Bail&#233;n, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+technology:+towards+a+new+generation+of+improved+CAR-T+cells+for+anticancer+therapies.">CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).</li><li>Li, C., Mei, H., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+explorations+of+CRISPR/Cas9+in+CAR-T-cell+therapy.">Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy.</a> Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> Elife. 2, 00471 (2013).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+choices:+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+(IL)-7+and+IL-15.">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+(CAR-T)+cells+expanded+with+IL-7/IL-15+mediate+superior+antitumor+effects.">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein &amp; Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li><li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4++T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions.">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li></ol>

כאן אנו מתארים גישות לעריכת תאי CAR-T בגנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas9 וייצור מוצרים לבדיקה נוספת לתפקוד ויעילות. הפרוטוקול לעיל עבר אופטימיזציה לביצוע עריכת גנים CRIPSR בתאי T אנושיים ראשוניים בשילוב עם תאי T הנדסיים עם קולטני אנטיגן כימריים. פרוטוקול זה מאפשר יעילות נוקאאוט גבוהה עם שונות מינ...

קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T טיפול בתאים חולל מהפכה בתחום הטיפולים האימוצים בתאים ואימונותרפיה של סרטן. תאי CAR-T מהונדסים תאי T המבטאים קולטן חיסוני סינתטי המשלב שבר נוגדן יחיד ספציפי לאנטיגן עם תחומי איתות הנגזרים משרשרת TCRzeta ותחומים עלותיים הכרחיים ומספיקים להפעלה של תאי T וגירוי משותף1,2,3,4 . הייצור של תאי CAR-T מתחיל על ידי חילוץ תאי T של המטופל עצמו, ואחריו transduction ויראלי ex vivo של מודול CAR והרחבת המוצר תא CAR-T עם חרוזים מגנטיים המתפקדים כאנטיגן מלאכותי המציג תאים5. תאי CAR-T מורחבים מוחדרים מחדש לחולה שבו הם יכולים לחרוט, לחסל תאים סרטניים היעד ואפילו להתמיד במשך מספר שנים לאחר עירוי6,7,8. למרות טיפול בתא CAR-T הביא שיעורי תגובה יוצאי דופן ממאירות תאי B, הצלחה קלינית עבור גידולים מוצקים כבר מאותגר על ידי גורמים מרובים כולל חדירה לקויה של תאי T9, microenvironment גידול מדכאחיסון 10, כיסוי אנטיגן וספציפיות, ותפקוד לקוי של תא CAR-T11,12 . מגבלה נוספת של הטיפול הנוכחי בתאי CAR-T כוללת שימוש בתאי T אוטולוגיים. לאחר סבבים מרובים של כימותרפיה ונטל גידול גבוה, תאי CAR-T יכולים להיות באיכות ירודה בהשוואה למוצרי CAR-T אלוגניים מתורמים בריאים בנוסף לזמן ולהוצאות הקשורים לייצור תאי CAR-T אוטולוגיים. עריכת גנים של מוצר תא CAR-T על ידי CRISPR/ Cas9 מייצגת אסטרטגיה חדשה להתגבר על המגבלות הנוכחיות של תאי CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 היא מערכת שני רכיבים שניתן להשתמש בה לעריכת גנום ממוקדת בתאי יונקים18,19. ה- Endonuclease Cas9 הקשור ל- CRISPR יכול לגרום להפסקות גדיל כפול ספציפיות לאתר בהנחיית RNAs קטנות באמצעות שיוך בסיס לרצף ה- DNA היעד20. בהיעדר תבנית תיקון, הפסקות גדיל כפול מתוקנות על-ידי נתיב ההצטרפות הלא-ההומולוגי (NHEJ) המועד לשגיאות, וכתוצאה מכך מוטציות של שינוי מסגרת או קודונים של עצירה מוקדמת באמצעות מוטציות הוספה ומחיקה (INDELs)19,20,21. יעילות, קלות שימוש, עלות-תועלת ויכולת לעריכת גנום מולטיפלקס הופכים את CRISPR/Cas9 לכלי רב עוצמה לשיפור היעילות והבטיחות של תאי CAR-T אוטולוגיים ואלוגניים. גישה זו יכולה לשמש גם לעריכת תאי TCR מכוונים TCR על-ידי החלפת מבנה הרכב ב- TCR. בנוסף, תאי CAR-T אלוגניים בעלי פוטנציאל מוגבל לגרום למחלות שתל לעומת מחלה מארחת יכולים להיווצר גם על ידי עריכת גנים של ה- TCR, b2m ו- HLA לוקוס.
בפרוטוקול זה, אנו מראים כיצד ניתן לשלב הנדסת CRISPR של תאי T עם משלוח וקטורי ויראלי בתיווך של CAR-Transgene כדי ליצור מוצרי תאי CAR-T בעריכת גנום עם יעילות ובטיחות משופרות. דיאגרמה סכמטית של התהליך כולו מוצגת באיור 1. באמצעות גישה זו, הדגמנו נוקאאוט גנים ביעילות גבוהה בתאי CAR-T אנושיים ראשוניים. איור 2A מתאר בפירוט את ציר הזמן של כל שלב לעריכה וייצור של תאי T. אסטרטגיות לעיצוב RNA מדריך ואימות נוקאאוט נדונות גם כדי ליישם גישה זו על גני יעד שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofactor Core Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofactor X-Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accuprime Pfx Supermix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12344040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima XPN ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317322</td>
			<td>Clone OKT3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV711 Anti-human PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
			<td>Clone EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9-Electroporation enhancers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3/CD28 Dynabeads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>40203D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation Kit</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>15062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8+ T cell isolation Kit</td>
			<td>StemCell technologies</td>
			<td>15063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning T150 cell culture flask</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag Magnet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huIL-15</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>huIL-7</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Gel and PCR cleanup</td>
			<td>Takara</td>
			<td>740609.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRPE expression Plasmid</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE</td>
			<td>CytoArt</td>
			<td>200105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spy Fi Cas9</td>
			<td>Aldevron</td>
			<td>9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral packaging mix</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Vivo-15 Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human crispr-engineered car-t cells

טיפולים תאיים מאמצים באמצעות תאי T קולטן אנטיגן כימרי (תאי CAR-T) הראו יעילות קלינית יוצאת דופן בחולים עם ממאירות המטולוגית והם נחקרים כעת עבור גידולים מוצקים שונים. תאי CAR-T נוצרים על ידי הסרת תאי T מדמו של המטופל והנדסתם כדי לבטא קולטן חיסוני סינתטי הנותב מחדש את תאי ה- T לזהות ולחסל תאי גידול ממוקדים. עריכת גנים של תאי CAR-T יש פוטנציאל לשפר את הבטיחות של טיפולים בתא CAR-T הנוכחי ולהגדיל עוד יותר את היעילות של תאי CAR-T. כאן, אנו מתארים שיטות להפעלה, הרחבה ואפיון של תאי CAR-T מכוונים של CD19 מהונדסים על ידי CRISPR האנושיים. זה כולל טרנס-אדוקציה של וקטור LENTIVIRAL CAR ושימוש ב- RNA מדריך יחיד (sgRNA) ו- Cas9 endonuclease כדי למקד גנים של עניין בתאי T. השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות באופן אוניברסלי על מבנים אחרים של CAR ולמקד גנים מעבר לאלה המשמשים למחקר זה. יתר על כן, פרוטוקול זה דן באסטרטגיות עבור עיצוב gRNA, בחירת gRNA להוביל ואימות נוקאאוט גן היעד כדי להשיג באופן פורה יעילות גבוהה, הנדסת CRISPR-Cas9 מולטיפלקס של תאי T אנושיים ברמה קלינית.

אנו מתארים כאן פרוטוקול להנדס גנטית תאי T, שניתן להשתמש בהם כדי ליצור הן תאי CAR-T אוטולוגיים ואלוגניים, כמו גם תאי TCR מנותבים מחדש.
איור 1 מספק תיאור מפורט של השלבים המעורבים בתהליך ייצור תאי T ערוכים CRISPR. התהליך מתחיל על ידי עיצוב sgRNA לגן העניין. ברגע sgRNA מעוצבים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells at JoVE.com

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

פרוטוקול המעבדה שלנו מאפשר שילוב של עריכת גנום אנושי עם טיפול בתאי CAR T. הליך המעבדה הוא הגישה עם CRISPR-Cas9 למיקוד של עד שלושה גנים ביעילות גבוהה. ולבסוף, הגישה שלנו יכולה להיות מתורגמת לניסויים קליניים בבני אדם.ניתן להחיל את השיטות המתוארות על מבנים אחרים של CAR ועל גנים ממוקדים. הבסיס של הטכניקות חזק מספיק כדי להיות מתורגם בקנה מידה גדול יותר למשתפי פעולה אקדמיים ותעשייה לפיתוח נוסף. בעת ניסיון לפרוטוקול זה בפעם הראשונה, הגבל את מספר הקבוצות במסך ה- RNA של המדריך כדי לאפשר זמני דגירה מדויקים.דבקות בתנאי התרבות וצפיפות הזריעה כמתואר הוכיחו את עצמם כקריטיים מניסיוננו. כדי להתחיל, להשיג תאים חד-גרעיניים אוטומטיים של דם היקפי, או מחשבים אישיים, מתורמים מתנדבים בריאים ולבודד תאי T חיוביים CD4 ו- CD8 באמצעות ערכות בחירה CD4 ו- CD8 זמינות מסחרית. שלבו תאי T חיוביים CD4 ו-CD8 חיוביים ביחס של אחד לאחד ודגרו 3 מיליון תאים למיליליטר ב-R10, בתוספת 5 ננוגרם למיליליטר של כל IL7 אנושי ו-IL15 אדם בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס.למחרת, לספור את תאי T וצנטריפוגה 5 עד 10 מיליון תאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. יש להשליך את כל כדורי העל ולשטוף את גלולה התא בסרום מופחת. להשעות מחדש את הכדור ב 100 microliters של פתרון חיבה גרעינית על פי הוראות היצרן.בעת שטיפת התאים, להכין ריבונוקליאופרוטאין, או קומפלקס RNP, על ידי דגירה 10 מיקרוגרם של נוקלאז Cas9 עם 5 מיקרוגרם של RNA מדריך יחיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כלול פקד מדומה ללא RNA של מדריך יחיד. שלב את התאים המושעים מחדש עם קומפלקס RNP והוסף 4.2 מיקרוליטרים של ארבעה משפרי אלקטרופורציה מיקרומולריים.מערבבים היטב ומעבירים לקובטות אלקטרופורציה. אלקטרופורציה התאים באמצעות קוד דופק EH111, ולאחר מכן לדגור 5 מיליון תאים למיליליטר ב R10, בתוספת 5 ננוגרם למיליליטר אדם IL7 ו IL15 אנושי ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ב 12 לוחות היטב. לאחר הדגירה, המשך עם הפעלה והרחבה של תאי T.עצב את פריימרי הרצף על-ידי הזנת הרצף של אמפליסון PCR לתוכנת עיצוב פריימר סטנדרטית. תוכנת העיצוב תציע רצפי פריימר מרובים המתאימים לרצף סנגר. בחר פריימרים קדמיים והופכים שנקשרים עם האמפליקון לפחות 150 זוגות בסיס במעלה הזרם או במורד הזרם של אתר חיתוך gRNA כדי להבטיח איכות רצף טובה סביב indels.השתמש בניתוח TIDE כדי לזהות יעילות נוקאאוט ברמה הגנומית. האלגוריתם משחזר במדויק את הספקטרום של indels מן עקבות הרצף ומחשב ערכי R ריבועי. לאחר ההפעלה, תאי T מורחבים בתרבית והקפאה שמורה למחקרים עתידיים.במהלך ההרחבה, מתבצע מעקב אחר הכפלת האוכלוסייה ושינויי אמצעי האחסון לאורך הפרוטוקול עבור תאי CAR T מדומים וערוכים כאחד. במהלך ההתפשטות לא התגלו שינויים משמעותיים בהתפשטות ובהפעלה. לאחר התאים היו cryopreserved, רמות של ביטוי CAR נקבעו למחקרים פונקציונליים נוספים עבור שני ערוך מדומה ותאי CAR T knockout.לא נצפו שינויים משמעותיים. יעילות נוקאאוט ניתן לקבוע באמצעות טכניקות מרובות. בחלקות ציטומטריית זרימה מייצגות אלה, ה- PDCD1 וה- TRAC loci היו ממוקדים באמצעות RNA מדריך יחיד, המציג יעילות של 90% עבור RNA מדריך יחיד PDCD1 ו - 98% עבור RNA מדריך יחיד TRAC על פני תורמים בריאים מרובים.חשוב לוודא שיחסי הטוחנת של Cas9 ו- RNAs המדריך מדויקים. במהלך ההליך, התאים תמיד צריך להישמר בארבע מעלות צלזיוס ולא להישאר בתמיסת אלקטרופורציה לתקופות ממושכות של זמן. לאחר שימור CAR, תאי ה- CAR T המהונדסים CRISPR יכולים לשמש לבדיקות פונקציונליות במבחנה וב- in-vivo, כגון בדיקות ציטוטוקסיות, ייצור ציטוקינים ומודלים של עכבר גידול סינגנטי או קסנוגרף.הגישה שלנו באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas9 מיושמת כעת בניסויים קליניים. הגישה יכולה לשמש הן לסרטן, כמו גם הפרעות גנטיות לא ממאירות, כגון hemoglobinophaties, אשר משפיעים על מיליוני ילדים ומבוגרים ברחבי העולם.

production-of-human-crispr-engineered-car-t-cells

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

Abstract