Tidsforløpavbildning av nevronal arborisering ved hjelp av sparsom adeno-assosiert virusmerking av genetisk målrettede retinalcellepopulasjoner

Å oppdage mekanismer som mønster dendritiske arbors krever metoder for å visualisere, bilde og analysere dendritter under utvikling. Mus netthinnen er et kraftig modellsystem for undersøkelse av celletypespesifikke mekanismer for nevronal morfogenese og tilkobling. Organiseringen og sammensetningen av retinal subtyper er veldefinerte, og genetiske verktøy er tilgjengelige for å få tilgang til bestemte typer under utvikling. Mange retinal celletyper begrenser også dendrittene og/eller axonene til smale lag, noe som letter tidsforløpavbildningen. Mus netthinnen explant kulturer er godt egnet for live-celle avbildning ved hjelp av confocal eller multiphoton mikroskopi, men metoder optimalisert for avbildning dendrite dynamikken med temporal og strukturell oppløsning mangler. Presentert her er en metode for å sparsomt merke og bilde utviklingen av spesifikke netthinnepopulasjoner preget av Cre-Lox-systemet. Kommersielt tilgjengelige adeno-assosierte virus (AAVs) som brukes her uttrykte membran-målrettede fluorescerende proteiner på en Cre-avhengig måte. Intraokulær levering av AAVer hos nyfødte mus produserer fluorescerende merking av målrettede celletyper med 4-5 dager etter injeksjon (dpi). Membranfluorescerende signaler kan påvises ved konfektavbildning og løse fine grenstrukturer og dynamikk. Videoer av høy kvalitet som spenner over 2-4 timer er anskaffet fra imaging retinal flat-mounts perfused med oksygenert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Også gitt er et bilde etterbehandling rørledning for dekonvolusjon og tredimensjonal (3D) drift korreksjon. Denne protokollen kan brukes til å fange opp flere cellulære atferd i den intakte netthinnen og for å identifisere nye faktorer som kontrollerer nevritt morfogenese. Mange utviklingsstrategier lært i netthinnen vil være relevante for å forstå dannelsen av nevrale kretser andre steder i sentralnervesystemet.