Vi takker National Natural Science Foundation of China (81672962), Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation, og Joint Key Project Foundation of Southeast University og Nanjing Medical University for deres støtte.

GBM prøve blev erhvervet fra en patient under en rutinemæssig operation efter at have indhentet fuldt informeret samtykke fra human forskning etiske udvalg af The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University.
1. Isolation og kultur af patientafledte GSC'er
<ol><li>Placer frisk kirurgisk resected glioblastoma væv i en 15 mL centrifuge rør fyldt med steril PBS og gemme vævet på isen indtil videre operation.</li>
	<li>Hakke GBM væv i ca 0,5 til 1 mm diameter stykker ved hjælp...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

I denne undersøgelse blev der beskrevet en protokol, der kan anvendes til at identificere potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte GSC'er. I modsætning til standard synergi / additivity metriske model såsom Loewe, BLISS, eller HSA metoder, en enkel og hurtig arbejdsgang blev brugt, der ikke kræver et lægemiddel par, der skal kombineres ved flere koncentrationer i en fuld factorial måde som de traditionelle metoder. I denne arbejdsgang blev SI (følsomhedsindeks), som stammer fra en unde...

Glioblastoma (GBM) er den mest almindelige og aggressive type primær hjernesvulst. I øjeblikket er den samlede overlevelse for GBM-patienter, der fik maksimal behandling (en kombination af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling) stadig kortere end 15 måneder; så nye og effektive behandlinger for GBM er presserende behov.
Tilstedeværelsen af glioom stamceller (GSC' er) i GBM udgør en betydelig udfordring for den konventionelle behandling, da disse stamceller spiller afgørende roller i vedligeholdelsen af tumormikromiljø, lægemiddelresistens og tumorrecidiv1. Derfor kan målretning af GSC'er være en lovende strategi for GBM-behandling2. Ikke desto mindre, en stor ulempe for lægemidlets effektivitet i GBM er dens heterogenetiske karakter, herunder men ikke begrænset til forskellen i genetiske mutationer, blandede undertyper, epigenetisk regulering, og tumor mikromiljø, som gør dem meget ildfast til behandling. Efter mange mislykkede kliniske forsøg indså forskere og kliniske forskere, at målrettet behandling med et enkelt middel sandsynligvis ikke er i stand til fuldt ud at kontrollere udviklingen af meget heterogene kræftformer som GBM. Mens omhyggeligt udvalgte lægemiddelkombinationer er blevet godkendt for deres effektivitet ved synergistisk at øge effekten af hinanden og dermed give en lovende løsning til GBM-behandling.
Selv om der er mange måder at evaluere narkotika-drug interaktioner af et lægemiddel kombination, såsom CI (Combination Index), HSA (Højeste Enkelt Agent), og Bliss værdier, etc.3,4, disse beregningsmetoder er normalt baseret på flere koncentration kombinationer. Faktisk kan disse metoder give bekræftende vurdering af interaktion mellem narkotika og narkotika, men kan være meget besværlige, hvis de anvendes i screening med høj overførselshastighed. For at forenkle processen blev der udviklet en screeningsarbejdsproces til hurtigt at identificere de potentielle lægemiddelkombinationer, der hæmmer væksten af GSC'er, der stammer fra kirurgiske biopsier af patient GBM. Et følsomhedsindeks (SI), der afspejler forskellen mellem den forventede kombinerede effekt, og den observerede kombinerede effekt blev indført i denne metode for at kvantificere den synergigivende virkning af hvert lægemiddel, så de potentielle kandidater let kan identificeres ved SI-ranglisten. I mellemtiden, denne protokol viser et eksempel skærm til at identificere de potentielle kandidater (r), der kan synergize anti-gliom effekt med temozolomide, den første linje kemoterapi for GBM behandling, blandt 20 små molekylære hæmmere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

Den gliom stamceller (GSCs) er en lille brøkdel af kræftceller, der spiller væsentlige roller i tumor indledning, angiogenese, og resistens i glioblastom (GBM), den mest udbredte og ødelæggende primære hjernesvulst. Tilstedeværelsen af GSCs gør GBM meget ildfast til de fleste af de enkelte målrettede agenter, så high-throughput screening metoder er nødvendige for at identificere potentielle effektive kombination therapeutics. Protokollen beskriver en simpel arbejdsgang for at muliggøre hurtig screening for potentiel kombinationsbehandling med synergistisk interaktion. De generelle trin i denne arbejdsgang består i at etablere luciferase-taggede GSC'er, forberede matrigelbelagte plader, kombinationslægemiddelscreening, analyse og validering af resultaterne.

XG387-cellerne dannede neurosfærer i det kulturmedium, der er beskrevet i tabel 1, i en ultralav fastgørelsesplade med 6 brøndskultur eller en ikke-belagt plade5 (Figur 1A). For det første blev der udført en test for at kontrollere, om bio-luminescensintensiteten fra XG387-Luc-cellerne var proportional med cellenummeret. Som vist i figur 1Bsteg bio-luminescensintensiteten proportionalt med celletætheden og resultere...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Gliom stamceller er underpopulation af celler i gliom, som normalt er resistente over for kemo og strålebehandling. Her beskrev vi metoden til hurtig identifikation af kombinationsbehandlinger, rettet mod glioom stamceller, i stedet for differentierede gliomceller. Sammenlignet med andre metoder, som kan være en besværlig og kompliceret.Denne protokol er en relativt enkel og hurtig, at identificere potentielle nyttige lægemiddelkombinationer. Begynd med at indsamle gliom stamceller eller GSCs fra kulturmediet, og centrifugere dem på 70 gange G i tre minutter ved stuetemperatur. Efter fjernelse af supernatanten fordøjes cellerne med accutase i fire minutter ved 37 grader Celsius.Ved hjælp af en 200 mikroliterspids pipetter pipetter cellerne gentagne gange for at adskille og genbruge cellepillen. Tilsæt GSC'erne ved en densitet på 200.000 celler i en milliliter kulturmedium, i hver brønd af en 12 brøndkulturplade, og inkuber dem natten over. Åh den næste dag, tilføje 30 mikroliter af luciferase-eGFP virus supernatant i hver brønd af pladen.Centrifuge cellerne på 1000 gange G i to timer, ved 25 grader Celsius og inkubere dem natten over. Den følgende dag skal du udskifte mediet i brøndene ved at samle GSC'erne, centrifugere dem, fjerne supernatanten, genoplive dem i frisk medium og formilde dem. Kultur cellerne i yderligere 48 timer.Overhold pladen under et fluorescerende mikroskop og bekræft udseendet af GFP-positive celler. Sorter og indsamle GSCs med en høj fluorescens ved hjælp af en flow celle sorterer og kultur dem yderligere. Coat, 96 godt optiske bundplader med en ekstracellulær matrixblanding, såsom matrigel, og inkuberer dem i en time ved 37 grader Celsius.Fjern den overskydende blanding og skyl forsigtigt pladerne en gang med PBS, så frø XG387-Luc celler ved en tæthed på 1000 celler i 100 mikroliter af kulturmediet og til hver brønd af de coatede plader og kultur dem natten over. Den følgende dag skal du observere cellerne under et mikroskop for at bekræfte deres fastgørelse til pladen. Derefter forberede en 200 mikromolar temozolomid løsning og to mikromolar løsninger af de målrettede midler, i kultur medium.Til kombinationsmedicinscreening skal du fjerne det tomme medium og tilføje det medium, der indeholder enten 200 mikromolar temozolomid eller to mikromolar målrettet middel, eller en kombination af begge, i hver brønd for tre tekniske replikper pr. behandling. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i tre dage. Tag billeder af den cellulære bioluminescens i pladen ved hjælp af IVIS spektrumbilleddannelsessystem.Ved hjælp af den indbyggede software skal du oprette flere cirkulære områder i interesseområdet og kvantificere den cellulære bioluminescens. For at identificere potentielle kandidater, der kunne forbedre antiglioblastoma effekt af temozolomid, 20 mål selektive små molekyle hæmmere blev analyseret gennem lægemiddelkombination screening. De følsomme indeksværdier på 13 målrettede agenter var over nul, og fem af dem var over 0,1.Det følsomme indeks for de to bedste kandidat narkotika UMI-77 og A 83-01, var højere end 0,25, hvilket tyder på deres potentiale til at synergisere med temozolomid. Den kombinerede behandling af temozolomid og UMI-77 blev evalueret ved hjælp af en anti-proliferativ analyse i en seks gange seks dosis titrering matrix. Kombinationsindeksværdierne var mindre end én.Og de høje enkeltagentværdier var større end nul for de fleste kombinationer af temozolomid og UMI-77 ved forskellige koncentrationer. Tyder på en samlet synergistisk interaktion mellem temozolomid og UMI-77 i både XG387 og XG328 GSCs. Denne protokol kan også anvendes i at finde lægemiddelkombination ved hjælp af klæbende kræftceller ved blot at fjerne pladen belægning trin.

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

Abstract